武夷菌素生物合成调控基因wysPIII的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明：wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知：wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

武夷菌素产生菌CK-15遗传操作系统的优化

旨在优化武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传操作系统,实现武夷菌素生物合成基因的高效敲除。以自杀性质粒pKC1132为载体,优化了外源DNA通过接合转移进入菌株CK-15的方法,确立了构建基因敲除突变株的最佳方案,最终成功得到了武夷菌素生物合成基因的双交换突变株。获得了菌株CK-15稳定高效的遗传操作系统,为进一步研究武夷菌素生物合成机理和对武夷菌素利用组合生物合成改造奠定基础。     

武夷菌素产生菌CK-15中转录调控因子wysR3的功能研究

wys R3是武夷菌素产生菌Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15中可能的调控因子。为了验证wys R3是否参与武夷菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于过表达wys R3的基因重组质粒p SETC-R,并通过接合转移的方法转化至武夷菌素产生菌S.wuyiensis CK-15中,构建过表达菌株。过表达菌株生长速度明显缓慢;通过摇瓶发酵和HPLC检测分析发现,武夷菌素产量与野生型菌株相比没有发生明显变化;DNS法测定发酵液中糖含量也没有发生明显变化,说明该基因与武夷菌素的产量和糖含量在该种条件下没有直接关系,但是影响菌株表型生长。     

武夷菌素部分生物合成基因簇的克隆和分析

不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15是从福建省武夷山土样中分离得到的一株链霉菌,其代谢产物武夷菌素对果蔬真菌病害具有良好的防治效果,但是因其产量低的缺点限制了武夷菌素工业化生产和农业生产中的应用。为了实现利用基因工程培育高产新菌株的目标,首先要获得武夷菌素的生物合成基因。根据大环内酯类抗生素聚酮合成酶基因设计引物筛选菌株CK-15的基因组文库,共获得9个阳性克隆。克隆和测序获得3个较长scaffold片段,序列总长度达53.291 kb,其中包含了14个可能阅读框,通过同源比对证实该序列与S.noursei ATCC 11455的制霉素生物合成基因有很高的同源性。本研究为进一步研究武夷菌素生物合成基因的功能,并通过基因工程培育高产新菌株奠定了基础。     

武夷菌素产生菌阻断突变株的筛选及分析

以不吸水链霉菌武夷变种Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis为出发菌株,分别用亚硝基胍、氯化锂、微波为单一诱变剂,亚硝基胍和氯化锂为复合诱变剂进行处理,从亚硝基胍处理的菌株中筛选到1株丧失抑菌活性且性状稳定的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形,孢子呈椭圆形,与出发菌株相比,在形态上没有显著变化且产孢量无变化。突变株的抑菌活性发生了显著变化,对所有8种供试菌株均无抑制作用。HPLC结果显示与出发菌株不同,突变株中抗生素的特征峰消失。本研究为今后开展武夷菌素合成途径和生物合成基因研究奠定基础。     

青枯菌Po82菌株Ⅲ型分泌系统调控基因hrpB的功能研究

本文以青枯菌致病力分化菌株Po82的Ⅲ型分泌系统调控基因hrpB为研究对象,采用同源重组双交换法,构建获得青枯菌Po82菌株的hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB及其互补菌株Po82ΔhrpB-pML123-hrpB,并对野生型菌株、突变株和互补菌株进行了致病力及生物学功能的验证。致病力测定结果表明,青枯菌hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB的致病力较Po82野生型菌株显著下降,而互补菌株Po82ΔhrpB-pML123-hrpB能够部分恢复突变菌株的致病力。生长曲线测定结果表明,在营养贫瘠型培养基中,hrpB基因缺失突变株Po82ΔhrpB的生长速率较野生型青枯菌Po82菌株快,但是在营养丰富型培养基中,两者生长速率基本一致。野生型和突变株的运动性测定结果显示,两者的运动性无显著差异。表明hrpB基因在青枯菌致病过程中具有重要影响,并对进一步发掘鉴定Po82菌株中新的Ⅲ型效应子,进而深入解析其致病力分化的分子机理具有重要的作用。     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

绿僵菌Ma55抗多菌灵突变株的诱变及抑菌作用研究

在室内条件下测定了供试绿僵菌对多菌灵的抗性。结果表明, 供试菌株对多菌灵均表现为敏感, 其中, Ma55菌株对多菌灵最敏感。采用分生孢子定向筛选的方法获得了金龟子绿僵菌抗多菌灵突变株, 测定了抗性突变株对多菌灵的抗性差异。结果显示, 在获得的抗性突变株中, MC-2的EC50最大, 达到397.064 3μg/mL, 对多菌灵的抗性水平最高, 抗性水平指数达到102.35。对Ma55抗多菌灵突变株的菌丝生长速率、产孢量及对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌的抑制效果的研究结果表明, 抗性突变株的菌丝生长速率均比亲本菌株Ma55小, 但产孢量均比Ma55大, 其中, MC-2的产孢量最大, 为5.12×106个/mL; MC-5次之, 其产孢量为4.81×106个/mL, MC-8的产孢量在抗性突变株中最低。平板对峙培养结果显示, 金龟子绿僵菌抗多菌灵突变株对棉花枯萎病菌和棉花红腐病菌菌丝生长的抑制作用均达到显著水平, 其中, MC-2对棉花枯萎病菌、棉花红腐病菌菌丝生长的抑制作用最强, 与亲本对照菌株Ma55差异不显著。     

抗氰烯菌酯假禾谷镰孢突变体的诱导及其生物学特性

为评估引起小麦茎基腐病的病原菌假禾谷镰孢Fusarium pseudograminearum对氰烯菌酯的抗性风险,对5株敏感菌株进行了室内药剂驯化,获得33株抗性突变体,突变频率为16.5%,其对氰烯菌酯的抗性水平范围为7.39～1 665.76倍,3株表现低抗,4株表现中抗,26株表现高抗;发现在myosin-5基因上存在11种抗性突变类型,其中217位的丝氨酸突变为亮氨酸(S217L)、420位的谷氨酸突变为赖氨酸(E420K)和135位的丙氨酸突变为苏氨酸(A135T)为主要突变类型,其比例分别为45.5%、15.2%和9.1%。S217L型抗性突变体的产孢量显著下降,菌丝生长速率和致病力与亲本菌株无显著差异。E420K型抗性突变体的菌丝生长速率和致病力显著下降,产孢量与亲本菌株无显著差异。A135T型抗性突变体的菌丝生长速率和产孢量与亲本菌株无显著差异。研究结果表明假禾谷镰孢在药剂选择压力下易形成氰烯菌酯的抗性群体,对氰烯菌酯存在中到高等的潜在抗性风险,其myosin-5的点突变与其对氰烯菌酯的抗性相关。     

丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选

为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。     

番茄叶霉病菌对氟硅唑敏感基线及抗药性风险研究

从辽宁省不同地区未使用过氟硅唑的保护地中采集番茄叶霉病叶,经单孢分离获得43株叶霉病菌。采用茵丝生长速率法测定其对氟硅唑的敏感性。结果表明,菌株间存在较大差异,EC50值最低为0.151 9μg／mL,最高达4.647 5 μg／mL。所有菌株的EC₅₀总平均值为1.253 1μg/mL,可作为番茄叶霉病菌对氟硅唑的敏感基线。野生菌株经紫外线照射,获得两个抗药性突变菌株,其抗药性倍数分别为6.0和7.6。突变菌株的菌丝生长速率及产孢能力显著低于原野生菌株。     

木霉耐盐突变菌株的紫外诱变选育

为了获得高效耐盐木霉突变菌株,以盐碱土中分离的一株深绿木霉T-YM作为原始菌株进行紫外诱变处理,并筛选了突变菌株的最佳诱变条件,利用NaCl溶液模拟盐胁迫条件测定了突变菌株耐盐指标生长速率、产孢量和菌丝生长量。结果表明,与对照(野生型菌株)相比,当诱变时间为3 min时能够显著提高深绿木霉T-YM突变菌株菌落生长速度和产孢量,分别增加17.69%和28.82%;诱变时间为0.5 min和5 min时能够显著提高突变菌株菌丝生长量,分别增加42.22%和46.67%。利用10 mg·mL^-1 NaCl溶液模拟盐胁迫条件时,与对照相比突变菌株菌落生长速度、产孢量和菌丝干重整体高于野生型菌株,尤其当诱变时间为3 min时,不同浓度盐胁迫下其产孢量平均增加51.18%,诱变时间为0.5 min时其菌丝干重平均增加23.65%;NaCl胁迫(10 mg·mL^-1)下,诱变处理0.5 min获得的正突变菌株经传代接种培养后其耐盐性较为稳定。因此,紫外诱变可作为一种选育高效耐盐木霉突变菌株的有效方法。     

番茄枯萎病菌转录因子FolMsn2的生物学功能

为探究转录因子FolMsn2在番茄枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici生长发育及致病过程中的作用,以番茄枯萎病菌野生型菌株4287为材料,利用基因敲除方法获得FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2及回补体菌株△Folmsn2-C,通过测定菌株的生长速率、孢子产量及致病力等表型初步分析番茄枯萎病菌中FolMSN2的生物学功能。结果显示,与野生型菌株4287相比,FolMSN2基因敲除突变体△Folmsn2生长速率显著减慢,菌株产孢量显著下降,仅为野生型菌株4287产孢量的6.7%;外界环境压力胁迫试验结果显示,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对渗透压、盐胁迫的敏感性显著提高,而对细胞壁、氧化压力胁迫变得更加耐受。此外,FolMSN2基因缺失突变体△Folmsn2对番茄苗及果实的致病力显著下降,进一步分析发现FolMSN2基因缺失影响其对玻璃纸的穿透能力;亚细胞定位结果表明,FolMsn2蛋白定位于细胞核内。表明FolMsn2参与调控番茄枯萎病菌的营养生长、无性繁殖以及对不同环境胁迫的应答过程,其可能通过影响菌丝对寄主的穿透能...     

产酶溶杆菌OH11双精氨酸转运系统关键基因tatC的功能分析

本研究采用同源重组的方法对产酶溶杆菌Lysobacterenzymogenes OH11中双精氨酸转运系统关键基因tatC进行缺失突变,通过对突变体表型及表型相关基因表达分析来研究该基因在菌株OH11中的功能,重点分析该基因与产酶溶杆菌中热稳定抗真菌因子HSAF生物合成的关系。研究结果表明,基因tatC的突变显著提高了HSAF生物合成的产量,以及HSAF生物合成的关键基因pks／nrps转录水平;改变了菌株OHll的细胞形态,使细胞从棍棒状变为椭圆状;并降低了菌株OH11生物膜的形成和滑动能力以及在营养缺陷型（10％TSB）培养基中的生长速率,但不改变其在营养丰富培养基（100％TSB）中的生长速率。此外,与野生型OH11相比,基因tatC突变株不改变其蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的产生水平以及其对瓜果腐霉Pythiumapanidermamm、立枯丝核菌Rhizoctoniasolani和禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum的拮抗能力。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

FocVel2基因对黄瓜枯萎病菌丝生长及毒力的影响

 由尖孢镰孢菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病是世界黄瓜生产上的一种毁灭性病害。本研究鉴定了尖孢镰孢菌黄瓜专化型丝绒蛋白的一个同源基因FocVel2,利用基因敲除和互补的方法研究该基因的功能。敲除突变体菌株ΔFocVel2出现明显的表型变化,包括菌落生长速率降低和产孢量降低,并且敲除突变株对黄瓜幼苗毒力明显减弱,回补突变体菌株能够恢复敲除突变体ΔFocVel2的所有缺陷。总之,研究结果发现丝绒蛋白基因FocVel2在菌体无性繁殖以及侵染过程中起到重要作用。     

高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响

为探究高温胁迫对禾谷镰孢生长和致病力的影响, 本研究测定了禾谷镰孢5株耐高温菌株和4株温度敏感型菌株在25℃和30℃下的菌丝生长速率、产孢量、孢子萌发率以及不同胁迫压力下的生长速率、致病力和DON毒素含量等。结果表明, 不论耐高温菌株还是温度敏感型菌株, 30℃高温对其菌丝生长均有抑制作用, 但对产孢量和孢子萌发有促进作用;30℃高温能减轻NaCl和CaCl2胁迫对禾谷镰孢生长的抑制, 但是不影响KCl、刚果红, SDS和H2O2对病原菌的抑制作用;在30℃下, 大部分耐高温菌株的致病力不变或降低, 而大部分温度敏感型菌株的致病力反而增加, 30℃对大部分菌株的DON毒素产量有一定促进作用。研究结果可为研究气候变化下小麦赤霉病的流行和预测提供理论基础。     

西瓜噬酸菌hflX基因功能分析

为明确GTP结合蛋白基因hflX在西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli中的功能尤其是对该菌致病力的影响,以西瓜噬酸菌Aac5菌株为材料获得hflX基因的缺失突变菌株及互补菌株,通过对致病力等表型以及相关基因表达量的测定初步探究西瓜噬酸菌hflX基因的功能。结果显示,同野生型菌株Aac5相比,缺失突变菌株的致病力显著下降,III型分泌系统基因hrpG和hrpE的表达量显著下调,仅为野生型菌株表达量的54.99%和27.39%;hflX基因的缺失并未影响其引起烟草过敏性坏死反应的能力;但缺失突变菌株的运动能力显著下降,鞭毛基因fliR和fliC的表达量显著下调,仅分别为野生型菌株的37.04%和29.68%。此外,缺失突变菌株的生物膜形成能力相较于野生型菌株显著增强了26.32%,同时,其体外生长能力也有所增强。表明hflX基因可能通过调控III型分泌系统基因hrpG和hrpE、鞭毛基因fliR和fliC的表达以及运动能力来影响西瓜噬酸菌Aac5菌株的致病力。     

金龟子绿僵菌fluG基因的敲除及对产孢的影响

丝状真菌的fluG基因参与调控分生孢子的生成,然而在昆虫病原真菌金龟子绿僵菌中fluG的作用鲜有研究报道。本研究利用DNA同源重组方法,构建敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株,分析突变株的产孢特性。以苯菌灵抗性基因ben作为筛选标记,fluG基因侧翼序列作为同源臂,构建了打靶载体pDHt/sk-fluG-Ben。利用PEG介导将打靶载体转化金龟子绿僵菌的原生质体,获得了苯菌灵抗性转化子。根据靶基因和标记基因检验,确定获得了敲除fluG的金龟子绿僵菌突变株。表型分析显示,fluG突变株继代培养5代仍保持苯菌灵抗性,菌落呈疏松毛絮状,生长相较野生型明显缓慢,不能或者仅能产生极少量分生孢子。说明fluG基因的敲除影响了菌株生长发育,并阻止了分生孢子形成,是金龟子绿僵菌产孢调节的重要基因。本研究为阐述金龟子绿僵菌产孢调控机制提供依据。     

基于转录组分析的哈茨木霉thga3基因功能研究

哈茨木霉Trichoderma harzianum Th-33的Ⅲ型Gα亚基Thga3可能参与调控木霉菌的生长、产孢、几丁质酶活性、疏水性等生物学过程。为进一步明确其功能,本研究采用Hiseq2500（Illumina）测序平台,对野生菌Th-33和thga3基因敲除突变株△thga3进行转录组测序,分析其G蛋白信号系统、细胞壁降解酶类和产孢相关基因的差异表达。与野生菌相比,△thga3有3个G蛋白偶联受体基因发生下调表达,3个几丁质酶基因以及产孢调控基因brlA下调表达,1个G蛋白信号调控蛋白RGS1上调表达。推测thga3可能通过调控brlA的表达正调控产孢;通过调控疏水蛋白基因Tha_09745的表达调控菌丝疏水性。此外,通过调控几丁质酶基因的表达、G蛋白信号网络中其他蛋白的表达,影响菌株的拮抗和重寄生能力以及其他生物学特性。本研究为进一步探索G蛋白信号途径调控木霉菌生防特性及其机制奠定了基础。