转Bt基因‘南林895’杨对美国白蛾和杨小舟蛾抗虫性分析

本研究以转Bt基因‘南林895’杨12个株系扦插苗为试验材料,分析其对美国白蛾和杨小舟蛾的虫害抗性。利用PCR、ELISA等技术对转抗虫基因杨树进行分子检测,同时在室内控制条件下对美国白蛾和杨小舟蛾进行抗虫性分析。PCR分析结果显示在12个转基因株系中均检测到了Bt目的基因片段。ELISA分析结果显示Bt毒蛋白浓度范围为371.9～10 698.2 ng/g,且不同株系间存在一定差异。转Bt基因杨树饲虫分析结果表明,12个转基因株系对美国白蛾和杨小舟蛾均有一定的杀虫活性,其中转基因株系A-4-6、A-5-0、A-3-4、A-5-23、Z-1-3的抗虫性较显著。株系A-5-0对杨小舟蛾1龄幼虫12 d校正死亡率达87.2%,对美国白蛾的18 d校正死亡率为65.6%。且转Bt基因‘南林895’杨对美国白蛾和杨小舟蛾幼虫的取食和生长有明显的抑制作用。在对12个转Bt基因株系的分子检测和饲虫试验中,Bt毒蛋白的表达水平存在差异且抗虫效果与Bt毒蛋白浓度的高低有关。     

转抗虫基因Cry1Iem大豆的分子鉴定与功能验证

通过转抗虫基因来提高作物的抗虫性是一条有效途径,以此来提高作物的产量和品质。本研究以转抗虫基因Cry1Iem大豆的T2、T3株系作为试验材料,利用常规PCR检测、Southern杂交、荧光定量PCR技术对转抗虫基因Cry1Iem株系进行分子鉴定;同时对40个转基因阳性株系进行室内人工接虫、200个转基因阳性株系室外网室接虫并进行抗虫性鉴定。选取其中10个株系进行常规PCR检测,结果在T2、T3当中都检测到了Cry1Iem、Bar、启动子CaMV35S、Nos目标片段,表明目的基因已被顺利导入受体JN28大豆植株当中并得到了稳定遗传;选取其中5个T2、T3转基因株系进行Southern杂交,结果显示:目的基因以单拷贝的形式整合到了大豆基因组当中;荧光定量PCR检测结果表明,Cry1Iem基因在选取的3个转基因株系中均得到了表达,而在非转化的受体JN28当中未检测到荧光信号。室内抗虫性鉴定结果显示40个转Cry1Iem基因株系豆荚内活虫的成活数量明显低于受体材料JN28大豆豆荚内的活虫数量,表明转基因材料具有显著的抗虫性。室外抗虫性鉴定结果表明:JN28大豆受体植株的虫食率为6.72%,属于感虫品种;而200个转Cry1Iem基因株系的平均虫食率为3.81%,属于抗虫品系。本研究结果为中国转基因抗虫大豆新品种的选育提供部分参考数据。     

基于花粉介导法转化的玉米自交系抗病植株的获得

【研究目的】将几丁质酶基因导入玉米自交系,获得抗玉米丝黑穗病的转基因植株。【方法】采用花粉介导法进行转化,获得的种子及后代植株检测方法包括：潮霉素抗性筛选、PCR扩增、Southern blot杂交分析以及田间抗病鉴定。【结果】通过转化获得种子43粒,对种子进行潮霉素抗性筛选得到9株抗潮霉素植株;经PCR检测,Southern blot杂交分析得到5株转基因植株。田间抗病鉴定结果显示,转基因植株或株系的丝黑穗病抗性提高1～2级。【结论】花粉介导法转化玉米自交系是获得抗病育种材料的一条快捷、有效的途径。     

转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探

【目的】为培育高抗草甘膦棉花新品种提供种质材料。【方法】对草甘膦抗性基因G10eve进行生物信息学分析,利用农杆菌介导的方式将G10eve导入到珂字棉312中。利用PCR(Polymerase chain reaction)、qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法分析G10eve的表达情况。对受体及转基因植株进行草甘膦喷施实验,测定其莽草酸含量,分析其抗性水平。【结果】最终获得28个独立的转基因阳性系,转化率及幼苗分化率分别高达49.3%、40.6%。PCR及qRT-PCR检测证明外源G10eve基因已经整合到棉花基因组中,且在不同转基因株系间表达量差异显著。在子叶期,转基因植株可耐受8 mL·L~(-1)浓度的草甘膦,而非转基因对照在2 mL·L~(-1)浓度草甘膦处理下已出现药害。草甘膦处理前后,转基因植株叶片莽草酸含量未出现明显积累,进一步说明其具有草甘膦抗性。【结论】过量表达G10eve基因能够提高受体材料对草甘膦的抗性,获得了高抗草甘膦的棉花株系。     

转bar基因小麦的抗性遗传及农艺性状分析

【研究目的】以皖麦48和扬麦87158两个小麦品种的转bar基因株系为材料,探讨bar基因在转基因小麦自交后代的遗传表现及对农艺性状的影响。【方法】利用涂叶法和PCR法研究bar基因在转基因植株自交后代T1、T2的遗传表现,并对产量及品质等主要农艺性状进行比较分析。【结果】证实抗除草剂bar基因已经整合到小麦基因组中,并能稳定表达;遗传分析显示bar基因能稳定的遗传给后代,符合孟德尔遗传规律;在产量及品质等主要农艺性状方面,转bar基因小麦与对照相比无显著差异。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体，获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系，并在正常生长条件下，比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化，分析了可能的分子机制。【结果】结果表明，正常生长条件下，转基因植株与野生型相比表现出萌发，幼苗生长以及开花阶段的生长抑制；气孔开度减小，叶片内源ABA含量降低；ABA信号传导基因表达增强，而ABA合成基因表达降低；而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应，抑制植株的生长发育。因此，在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

棉花FAD2-1基因的RNAi载体构建及高油酸新种质的获得

【目的】在棉花纤维产量和品质不受影响的前提下,创造高油酸、低亚油酸棉花新种质。【方法】棉花FAD2-1基因是催化单不饱和脂肪酸的油酸形成多不饱和脂肪酸的亚油酸的关键基因,采用信息分析学方法分析其蛋白质性质、结构、功能;克隆GhFAD2-1的保守片段381 bp,构建RNA干涉载体,采用农杆菌介导的下胚轴侵染方法将干涉载体转入棉花。利用气相色谱-质谱联用仪(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)测定转基因T_2～T_4植株种子的脂肪酸成分及含量。对T_4转基因株系进行拷贝数鉴定、目的基因表达量检测、农艺性状及纤维品质考察。【结果】成功构建GhFAD2-1的RNA干涉载体并转入棉花,转基因株系目的基因GhFAD2-1的表达量显著低于对照,具有高油酸、低亚油酸的表型并且能稳定遗传给后代;转基因株系可将棉花种子油酸提高224.1%,将亚油酸降低237.5%。与对照材料相比,转基因株系的农艺性状、纤维品质没有明显差异。【结论】验证了棉花GhFAD2-1基因的功能并且为培育高油酸棉花品种提供了帮助。     

几个水稻新品种(系)对褐飞虱的抗性评价

【研究目的】评价几个水稻新品种（系）对褐飞虱的抗性。【主要方法】用苗期鉴定、分蘖期蜜露量测定以及田间褐飞虱种群动态调查及测产的方法评价几个水稻新品种（系）对褐飞虱的抗性。【主要结果】从苗期鉴定、分蘖期蜜露量测定以及田间褐飞虱种群动态调查及产量测定的综合结果看出,应用分子标记辅助育种导入了Bph14 和Bph15基因培育的新品系,即沪旱1A/07WH1462、川香29A/07WH644、川香29A/07WH1462、中9A/07WH1462、沪旱1A/07WH644和中9A/07WH644对褐飞虱均存在一定的抗虫性,前三种苗期表现为抗级,后三种苗期表现为中抗;主栽品种珞红3A/610234为感虫,主栽品种两优培九为高感。在整个生育期不追肥、不施用农药的情况下,抗-中抗品系中以中抗品系中9A/07WH1462的667m2产量最高,比主栽品种两优培九的产量高约14.8%。【结论】若进行科学管理水肥,中9A/07WH1462品系的产量会更高,可见中9A/07WH1462抗虫品种具有推广应用前景。     

连续回交对消除农杆菌介导转化引起水稻体细胞变异的影响

农杆菌介导的转化引起许多体细胞变异, 影响了转基因植物的农艺性状。因此, 转基因作物的培育需要大量的T₀代再生植株。在本研究中, 我们将转基因水稻株系与原始品种连续回交, 然后评价其回交后代的表现, 消除体细胞变异, 恢复转基因亲本的农艺性状。回交的供体亲本是3个转基因水稻株系, 分别带有来自于苏云金芽胞杆菌(Bt)的抗虫基因。与原始品种连续回交至BC₃F₁代, 每代BC_nF₁单株再自交两代, 同时对各个世代进行抗虫性选择。通过发芽试验获得转基因纯合的BC_nF₃株系, 在室内抗性试验中, 所有的BC_nF₃纯合株系都能杀死100%的幼虫。在田间试验中, 这些株系的单株产量明显高于供体亲本, 大部分农艺性状与原品种没有显著的差异。这些结果说明连续回交能够在很大程度上恢复转基因水稻株系的农艺性状, 从而减少转基因育种过程中所需的工作量。     

十三种农药对美国白蛾三龄幼虫触杀作用研究

在室内利用十三种不同类型的农药对美国白蛾三龄幼虫进行了触杀作用研究,结果表明,20%灭多威悬浮剂对美国白蛾击倒速度最快, 在24h的致死效果就达100%,而三种拟除虫菊酯类农药和1.1%苦参碱.?烟碱水剂在36h对美国白蛾的幼虫的致死作用都达到100%,80%敌敌畏乳油在48H的致死作用也达到100%,1.8%阿维菌素乳油4000倍液在72h的触杀效果达到了98..2%,而25%灭幼脲3号悬浮剂和0.3%保硕1号水剂1500-4500倍在72h对美国白蛾的致死作用仅达到12.71%-39.99%,另外两种仿生农药和植物源农药对美国白蛾的致死作用在72h仍然很低;另外,还对十三种农药毒力回归方程进行了拟合并计算出了LC50。     

中国转基因抗虫棉的研究利用现状及发展对策

（湖南农业大学棉花研究所,长沙 410128）     

人工模拟“庇护所”和“非庇护所”条件下棉铃虫对Bt棉的抗性演变

 人工饲料中添加转Bt基因杂交棉品种中棉所29棉仁粉,建立杂交和自交品系分别模拟“庇护所”和“非庇护所”条件,连续多代进行棉铃虫对Bt棉的抗性筛选。结果表明：经11代筛选,棉铃虫自交品系和杂交品系的幼虫死亡率下降,体重和体长增加,幼虫历期缩短,化蛹率和羽化率增加。依据幼虫死亡率、体重、体长、幼虫历期以及化蛹率、羽化率等生命参数的演变,相较杂交品系,自交品系对Bt棉能更快地产生适应性。11代筛选后,利用不同抗性品系棉铃虫进行转基因棉抗虫性评估,结果表明：相比敏感品系,杂交品系测定4个转基因棉品种的抗虫性等级未发生变化,而中棉所29等3个转基因棉品种对棉铃虫自交品系的抗性下降了1个等级。对Bt制剂的抗性测定结果表明,杂交品系的抗性倍数为2.5215,自交品系的抗性倍数为9.3876。据本研究初步结果,利用“庇护所”策略延缓棉铃虫对转Bt基因棉的抗性产生是可行的。     

2005-2020年转Bt基因棉花抗虫性变化及其与产量性状的相关性分析

为了给转Bt基因棉花在科研和生产上多世代可持续利用提供依据,以转Bt基因棉花品种银山8号为试验材料,从2005年开始,连续16年进行跟踪研究。结果表明,随种植世代的增加,生物测定银山8号第2～4代棉铃虫幼虫校正死亡率、铃期叶片和铃期小铃杀虫蛋白表达量均有不同程度的线性上升趋势,同时皮棉产量线性回归也呈增长趋势;苗期叶片、蕾期叶片和蕾期小蕾杀虫蛋白表达量呈线性下降趋势。相关性分析表明,抗虫棉的抗虫性与皮棉产量间均呈正相关,株铃数和衣分是构成皮棉产量的重要因子,与皮棉产量的相关性分别达到极显著和显著水平。外源Bt基因转入棉花后能稳定遗传给后代,通过卡那霉素鉴定和系统选择可以持续保持转Bt基因棉花多世代的抗虫性,甚至通过提纯复壮逐年优选,可实现转Bt基因抗虫棉特定生育时期或部分棉花器官抗虫性的提高。     

棉花转基因材料的获得及主要农艺性状变异分析

 利用不同棉花受体材料进行花粉管通道法遗传转化研究。通过卡那霉素鉴定、抗虫性鉴定和PCR分子生物学鉴定,证明已成功将Bt基因转化到泗棉3号、辽棉15、中棉所19、中棉所29母本、中棉所35、中棉所36等棉花材料中。通过对转基因材料后代与非转基因材料的铃重、衣分和纤维品质等差异分析,发现花粉管通道转基因后代材料存在广泛的变异。     

转基因抗草甘膦抗虫棉田害虫群落多样性季节动态研究

为了明确转基因抗草甘膦抗虫棉对棉田害虫群落多样性的影响,于2010-2012年,在田间隔离条件下,采用直接观察法,分析比较多样性指数、优势集中性指数、均匀性指数、优势种和优势度等相关参数。结果表明,在6月中下旬及7月中下旬至8月上旬,转基因抗草甘膦抗虫棉田害虫群落多样性指数和均匀性指数显著高于常规棉,而其优势集中性显著低于常规棉;与Bt棉相比,二者在同时期的害虫群落参数变化趋势基本一致,差异不明显。3种棉田在其他时段的群落参数变化趋势一致,无明显差异。同时,转基因抗草甘膦抗虫棉田的优势害虫种类比较稳定;因此,种植该双抗棉对棉田害虫群落结构的影响较小,不会扰乱害虫群落的稳定性。     

三倍体毛白杨快繁技术研究

以4份三倍体毛白杨无性系为供试材料,比较了培养基中激素种类及浓度、大量元素浓度以及有机添加物香蕉、椰汁和马铃薯对三倍体毛白杨快速繁殖中繁殖系数及玻璃苗频率的影响,结果表明：培养基中2/3大量元素含量能降低玻璃苗频率;添加0.5mg/L 6-BA和0.01mg/L NAA 获得较高的繁殖系数;添加15%的椰汁能提高繁殖系数并降低玻璃苗频率;不同无性系之间的繁殖系数和玻璃化频率无明显差异。     

陆地棉抗虫品种不同年份间农艺性状的比较

笔者对3个陆地棉抗虫品种在两年间的农艺性状和纤维品质性状进行了研究。结果表明,3个抗虫棉品种的产量性状年份间表现基本一致,而纤维品质性状差异较大。新棉33B在3个抗虫棉品种中产量性状表现最好。品种与年份的互作极为显著,2002年新棉33B在籽棉产量和皮棉产量上显著高于对照品种中棉所12号,而在2003年则与对照品种产量相当。JS166在单株籽棉产量和单株皮棉产量、单株铃数、单铃重等性状上两年间表现均较好,2003年还有较低的蕾铃脱落率。99035两年间在产量性状上与对照相比略有提高,但差异并不明显。所有3个抗虫棉品种2002年的纤维品质指标与对照相当,而2003年纤维长度和纤维整齐度明显高于对照。     

转Cry1A基因海岛棉的获得和鉴定

进行农杆菌介导转抗虫基因试验，以期选育抗虫性优良的海岛棉新品系(品种)；本实验在海岛棉体细胞胚再生体系的基础上，将携带Cry1A基因的表达载体pBI121通过农杆菌介导法转化到‘新海33号’的胚性愈伤组织中。经培养基筛选、PCR检测、RT-PCR检测、抗虫性鉴定等筛选抗虫后代。经培养基筛选共获得12棵抗性植株。PCR检测结果显示，这12棵抗性植株均能扩增出了大小相符的片段，检测结果呈阳性；RT-PCR结果显示，12棵转基因植株目的基因已经整合入基因组，且能反转录出mRNA；Bt-Cry1Ab/Ac转基因试纸条检测结果表明这12棵转基因植株含有目的蛋白；抗虫性鉴定结果证实了这些转基因植株对棉铃虫幼虫具有一定的抗性。本研究成功将抗虫基因导入至海岛棉的体内，获得了具有抗虫性的植株，其结果对转基因抗虫海岛棉新品种的培育具有一定的参考价值。