抑制素及其在畜牧上的应用

对脑垂体分泌的促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)的调节,是繁殖内分泌研究中受到普遍关注的项目之一。在各种动物中常观察到血清中LH和FSH浓度的单独改变。这表明,LH和FSH有不同的调节机制。研究表明,睾丸支持细胞或卵泡颗粒细胞分泌的抑制素对FSH有选择性抑制作用。本文就抑制素的研究情况及其在畜牧上的应用作一概述。     

基质金属蛋白酶 MMP2 和 MMP9 在哺乳动物卵泡发育中的作用研究进展

在哺乳动物卵泡发育过程中,卵泡腔的形成和扩张、排卵、黄体化以及闭锁等伴随明显的组织重塑。卵泡膜细胞和颗粒细胞的细胞外基质及卵泡液中含有大量的明胶蛋白、纤维蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等,这些活性蛋白为卵泡膜细胞和颗粒细胞的迁移、增殖和分化提供了必要条件。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases 2,MMP2)和酶-9(MMP9)在其他MMPs、雌激素、凋亡和自噬信号通路的协同作用下,分解细胞外基质和卵泡液中的明胶蛋白、纤维蛋白和Ⅳ型胶原蛋白等,促进细胞凋亡和血管生成,使卵巢组织发生降解和重塑,进而影响卵泡膜细胞和颗粒细胞的功能、卵泡腔的形成及扩张,调控卵泡的生长发育。针对MMP2和MMP9调节卵泡生长、排卵、黄体化及闭锁的研究进展进行综述。     

抑制素质粒(pCISI)DNA卵黄抗体的制备

抑制素是一种性腺糖蛋白,是由α、β亚基组成的二聚体,在卵巢局部起着旁分泌、自分泌的调节作用,调节卵泡的发育和类固醇激素的发生,主要作用是抑制卵泡刺激素(FSH)[1-4]在垂体的分泌与合成.     

C型尿钠肽在动物卵巢表达及对生殖机能影响的研究进展

C型尿钠肽（C-type natriuretic peptide, Cnp）为尿钠肽家族成员之一,广泛分布于动物大脑、肾脏、心脏及血管等组织,具有维持心血管系统功能稳态、调控细胞增殖及促进骨骼生长等功能。普遍认为哺乳动物有3种钠尿肽受体(Natriuretic peptide receptor, NPR) ：NPR1,NPR2和NPR3。Cnp主要通过结合NPR2受体激活下游信号通路,发挥生物学作用。Cnp信号传导通路的组成成分主要包括：配体（Cnp）、跨膜受体（NPR2）及cGMP等。当Cnp分子与跨膜受体NPR2结合后,使受体的激酶同型区域（kinase homology domain, KHD）构象发生变化,进而激活鸟苷酸环化酶,将GTP转化为cGMP后激活下游信号通路。目前,许多研究表明Cnp及受体在雌性动物卵巢上表达模式相似,Cnp主要在卵泡壁层颗粒细胞上表达,NPR2受体主要在卵丘颗粒细胞上表达。另外,动物体内卵泡生长期间,Cnp和受体Npr2表达受激素调控,FSH通过雌激素介导促进卵泡颗粒细胞Cnp和受体Npr2表达;同时卵母细胞通过分泌卵母细胞分泌因子促进了颗粒细胞Npr2表达。LH可能通过表皮生长因子信号通路降低卵泡颗粒细胞Cnp和受体Npr2表达。值得注意的是,研究表明Cnp与FSH功能类似能够促进动物卵泡发育,有利于卵丘颗粒细胞的形成,并能诱导一些与卵泡成熟和类固醇合成相关的颗粒细胞基因表达,揭示卵泡颗粒细胞分泌的Cnp与FSH具有类似的功能,作用于颗粒细胞上的受体分别经由cGMP和cAMP的信号通路影响颗粒细胞基因表达,刺激卵泡生长,促进卵母细胞成熟。另外,近年研究揭示Cnp是动物体内维持卵母细胞减数分裂阻滞的关键物质,卵泡壁层颗粒细胞分泌的Cnp,作用于卵丘颗粒细胞上的受体NPR2,激活鸟甘酸环化酶后将cGTP转化为cGMP,cGMP进入卵母细胞后抑制磷酸二酯酶phosphodiesterase, PDE)的活性,维持卵母细胞内高水平的cAMP,卵母细胞内高水平的cAMP通过激活蛋白激酶A（protein kinase A, PKA）使成熟促进因子（maturation promoting factor, MPF）的催化亚基磷酸化,进而抑制MPF的活性、维持减数分裂阻滞,但对裸卵没有影响,说明Cnp通过作用卵丘颗粒细胞间接影响卵母细胞减数分裂成熟。此外,研究表明Cnp体外前处理卵丘卵母细胞复合体,有利于卵母细胞胞质成熟,提高了成熟受精后的发育能力。综上,动物体内卵泡生长期间,卵巢内产生的Cnp可能通过影响颗粒细胞的正常功能,在维持卵母细胞减数分裂阻滞的同时促进胞质成熟,保证成熟受精后具有较高的发育能力。基于此,Cnp在用作生理性的减数分裂阻滞剂增强家畜卵母细胞体外发育方面将具有重要的应用前景。因此,论文综述了Cnp结构、信号转导通路、在动物卵巢上表达及对卵巢生殖机能的影响。     

褪黑激素对雌性动物生殖系统调节作用的研究进展

褪黑激素的分泌具有日节律和季节性节律,对季节性繁殖动物的生殖功能具有重要的调节作用。大量研究表明,褪黑激素对生殖系统的影响因动物种类、生理状况的不同而表现出多重性,具有促进、抑制作用或无作用。褪黑激素对于牛、鼠类、禽类、人等均具有抑制生殖作用,对于绵羊、鹿等动物均具有促进生殖作用,而对光不敏感的动物无作用。光照对生殖机能的调节依靠褪黑激素介导传递到下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴。褪黑激素调节下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH),而GnRH调控LH和FSH的分泌,进而调节性腺水平的生殖功能。近年来的研究表明,褪黑激素也可直接作用于卵巢,调控雌性动物的生殖系统及功能。     

免疫抑制素和卵泡抑素阻止夏季热应激导致的猪精液品质下降的研究

[目的]通过免疫抑制素和卵泡抑素促进精子发生,在夏季热应激状态下保持公猪精液品质.[方法]在夏季热应激状态下对精液品质出现下降的成年种公猪单独免疫抑制素、或联合免疫抑制素α亚基和卵泡抑素重组蛋白(n=6)3次,每次间隔21 d;然后在9周试验期间定期采血测定血液抗体效价、FSH和睾酮浓度,每周采精观察精子活力和精子密度作为精液品质指标.[结果]抑制素单独免疫、抑制素和卵泡抑素联合免疫都使猪血液中抗抑制素的抗体效价显著高于对照组值(P<0.01),联合免疫也使猪血液中抗卵泡抑素的抗体效价显著高于对照组值(P<0.01).单独免疫或联合免疫都显著升高了血液FSH浓度;联合免疫还升高了血液睾酮水平.在试验期间对照组中猪的精子活力持续下降,而两免疫组的精子活力都上升,其中联合免疫猪的精子活力显著高于对照组猪.试验开始时对照组猪精子密度显著高于两免疫组,但在试验期间持续下降;而免疫组中猪精子密度在试验期间未下降,特辑是在联合免疫组于试验后期还显著高于对照组猪.[结论]免疫抑制素和卵泡抑素可以促进公猪FSH和睾酮分泌,克服夏季热应激的不良影响,促进猪精子发生,并提高精液精子活力和密度,有望用于热应激状态下保持种用公猪的繁殖性能.     

一种优化的猪卵泡颗粒细胞分离方法及验证

目前,进行体外研究的卵泡颗粒细胞主要通过抽取卵泡液的方式获得。而笔者前期研究发现,通过该方式获得的颗粒细胞贴壁率低且活力差。为解决该问题,在抽取方式的基础上采用FICOLL-Paque分离液对细胞进行进一步纯化,并通过CCK-8、Western Blot、免疫荧光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分别对纯化细胞的形态、增殖能力、激素分泌相关受体(FSHR、LHCGR)和基因(CYP19A1、CYP11A1、StAR)的表达及激素分泌情况进行检测。结果发现,经纯化的细胞贴壁能力、细胞形态和增殖能力明显改善,且各激素分泌相关基因都有表达;E2分泌量明显提高,而P4分泌明显降低。研究结果表明,经FICOLL-Paque分离液纯化后的猪卵泡颗粒细胞中黄体化的颗粒细胞被大部分清除,纯化后的细胞活力更好且更能体现出颗粒细胞的特性。     

绵羊卵巢卵泡颗粒细胞体外培养中促卵泡素和胰岛素浓度优化研究

为了进一步探讨在无血清体外培养条件下,促卵泡素(FSH)和胰岛素对绵羊卵巢颗粒细胞的影响,以优化颗粒细胞体外培养体系。试验设计6个FSH浓度梯度和3个胰岛素浓度梯度。体外培养7d后,检测培养体系中颗粒细胞数和雌激素浓度。与对照组相比,培养液中添加FSH与胰岛素可显著提高颗粒细胞的增殖和雌激素的分泌(P<0.01);且随着FSH浓度的增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当FSH浓度为5.0μg·L-1时,雌激素分泌量最高;随着胰岛素浓度增加,颗粒细胞数和雌激素分泌量显著增加,当胰岛素浓度为10μg·L-1时,颗粒细胞数和雌激素分泌量最高。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

抑制素基因免疫技术的研究进展

抑制素(Inhibin,INH)是一种由雌性动物的卵泡颗粒细胞和雄性动物的睾丸支持细胞分泌的糖蛋白激素.抑制素免疫可以促进卵巢卵泡发育,提高动物的繁殖力.抑制素基因免疫是近几年发展起来的动物繁殖新技术.通过对基因免疫的优点、效果、影响免疫效果的因素以及基因免疫在养禽业中的应用前景和存在的问题加以阐述,提出了未来研究的方向.     

Dynamic changes in inhibin messenger RNAs in rat ovarian follicles during the reproductive cycle

The alterations in morphology and function of the ovarian follicle as it matures, ovulates, and becomes a corpus luteum are dramatic. A variety of steroid and polypeptide hormones influence these processes, and the ovary in turn produces specific hormonal signals for endocrine regulation. One such signal is inhibin, a heterodimeric protein that suppresses the secretion of follicle-stimulating hormone from pituitary gonadotrophs. Rat inhibin complementary DNA probes have been used to examine the levels and distribution of inhibin alpha-and beta A-subunit messenger RNAs in the ovaries of cycling animals. Striking, dynamic changes have been found in inhibin messenger RNA accumulation during the developmental maturation of the ovarian follicle.     

双拷贝抑制素基因免疫对肉牛卵泡和黄体的影响

 【目的】探讨不同剂量的双拷贝抑制素pcISI基因免疫对肉牛生殖能力的影响。【方法】将58头同期发情肉牛随机分为6组, 每组肉牛分别注射0.75（T1）、1.5（T2）、2.25（T3）、3.0 mg/头（T4）pcISI质粒、3.0 mg/头 pcMV-S空质粒（C1）和3 mL/头 生理盐水（Ｃ2）,初次免疫21d后进行加强免疫,以探讨抑制素pcISI基因疫苗对肉牛卵泡和黄体发育的影响。【结果】4个剂量组的大卵泡数均高于对照组,除了T1外,其它3个剂量组均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3和T4的中卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）;T3和T4的小卵泡数均高于对照组,且差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,各剂量组成熟卵泡直径均高于对照组,除了T1外,其它3组两侧成熟卵泡均与对照组差异显著（P＜0.05）。无论左侧还是右侧,4个剂量组黄体直径均高于对照组,且均与对照组差异显著（P＜0.05）;T3黄体最大,T1最小,且T3与T1差异显著（P＜0.05）。加强免疫后10 d（BM10）抑制素抗体与成熟卵泡大小相关显著（r＝0.629,P＜0.05）,与黄体大小相关极显著（r＝0.651,P＜0.01）。【结论】双拷贝抑制素pcISI基因免疫可促进肉牛卵泡和黄体发育,2.25mg为最佳免疫剂量,抑制素抗体水平与卵泡和黄体发育有一定的相关性。     

抑制素基因免疫黄牛的黄体发育与免疫纯度及剂量的关系

为探讨双拷贝抑制素pcISI基因疫苗纯度和剂量对肉牛黄体发育的影响,将150头同期发情的南阳黄牛随机分为8个试验组和2个对照组,试验组用pcISI按2种纯度、4种剂量(0.75、1.50、2.25、3.00 mg/头)进行免疫处理,2个对照组分别用空质粒和生理盐水进行处理;初次免疫21 d后进行加强免疫。结果表明:无论用高纯度还是低纯度疫苗免疫,2.25 mg/头剂量处理对黄体的作用效果最明显,且抗体水平与黄体发育密切相关,2.25 mg/头抑制素融合表达质粒组的黄体显著大于0.75 mg/头组(P<0.05),抗体阳性牛两侧黄体显著比抗体阴性牛的大(P<0.05)。     

雌性鸭胚胎和雏鸭的抑制素和促性腺激素的分泌

测定了从孵化 ２１ ｄ 到出壳后 １ 日龄雌性鸭胚胎和初生雏 鸭外周及卵巢中具免疫活性的抑制素含量，同时也测定了促卵泡生成素（ Ｆ Ｓ Ｈ）和促黄体生成素（ Ｌ Ｈ）的含量⒚在判定有效后，用牛的抑制素放射免疫系统测定抑制素的含量⒚在第 ２１ 日至 ２５ 日时胚胎血浆中抑制素含量处于低水平， 到第 ２６ 日达到最大值，第 ２７ 日稍降后，抑制素含量在出生后快速下降⒚ Ｆ Ｓ Ｈ 含量在胚胎期无显著变化，其含量的变化与外周抑制素含量的变化相对独立⒚卵巢中抑制素含量在孵 化的第 ２５ 日有显著下降，并于第 ２６ 日时快速回升⒚卵巢和血浆中 抑制素的含量在整个研究阶段后者比前者高约 １０ 倍 ⒚血浆 Ｌ Ｈ 从第 ２１ 日开始下降，至第 ２５ 日 接着有所回升并于第 ２７ 日达第二峰值⒚总之，血浆抑制素和 Ｆ Ｓ Ｈ 在雌性鸭胚胎中不存在负反馈关系， 这预示着胚胎期抑 制素的主要作用 不是抑制垂体分 泌 Ｆ Ｓ Ｈ，同 样 Ｆ Ｓ Ｈ 也不影响抑 制素的分泌⒚     

促性腺激素释放激素在不同品种水牛卵巢中的免疫组化定位

【目的】了解促性腺激释放激素（GnRH）在广西沼泽型水牛与摩拉杂交水牛卵巢中定位表达的异同点,为深入阐明GnRH调节卵巢功能的机制提供理论依据。【方法】采用免疫组化SP染色法对广西沼泽型水牛和摩拉杂交水牛卵巢中GnRH及其受体的分布表达进行对比研究。【结果】两种不同品种水牛卵巢中均存在大量的GnRH阳性细胞,且主要位于颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内;通过比较显示,两种不同品种水牛卵巢GnRH阳性细胞个数差异极显著（P〈0．01）,但GnRH阳性细胞大小及其平均光密度的差异均不显著（P〉0．05）。【结论】不同品种水牛卵巢的GnRH分布差异可能与繁殖性能有关,但主要分布于巢卵颗粒层细胞和黄体粒细胞的胞质内。     

Inhibin-mediated feedback control of follicle-stimulating hormone secretion in the female rat

The secretion of follicle-stimulating hormone (FSH) by the anterior pituitary gland is regulated by the interaction of hypothalamic and gonadal hormones. Recently, proteins termed inhibins that selectively suppress FSH secretion have been purified and characterized from the gonadal fluids of several species. Antibodies to a synthetic peptide encompassing the amino terminal 25 residues of the recently characterized porcine inhibin were used to develop a specific radioimmunoassay (RIA) for inhibin and to neutralize endogenous inhibin during the estrous cycle of the rat. The administration of 20 international units of pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) stimulated the secretion of inhibin in intact immature female rats, whereas ovariectomy caused an abrupt decrease in plasma inhibin concentrations that were not prevented by the injection of PMSG. The infusion of a polyclonal antiserum to inhibin, from 12 noon on proestrus to 1 a.m. on the morning of estrus, as well as its acute intravenous injection during diestrus I or II, caused an increase in plasma FSH (but not luteinizing hormone) concentrations. These results support the hypothesis of a feedback loop between the release of ovarian inhibin and FSH in the female rat.     

新疆细毛羊超数排卵效果研究

[目的]提高并稳定新疆细毛羊超数排卵效率,为以生产2~8-细胞期胚胎的转基因研究提供素材.[方法]分别从激素生产厂家、供体年龄、激素处理方案等3个方面探讨新疆细毛羊的超数排卵效果,确定新疆细毛羊超数排卵供体羊的最佳年龄及其有效处理方案.[结果]不同生产厂家的激素对新疆细毛羊黄体数和可用胚胎数均存在极显著影响(P<0.01):1.5周岁以内的新疆细毛羊超排后,其黄体数(6.17个/只)和可用胚胎数(1.50枚/只)均极显著低于2.0周岁以上的新疆细毛羊(黄体数12.24个/只,可用胚胎数8.30枚/只)(P<0.01);FSH剂量在150~200 U/只范围内不影响超排效果和胚胎质量( P>0.05):FSH+PMSG超排处理的新疆细毛羊黄体数(6.05个/只)和可用胚胎数(1.76枚/只)则显著低于FSH+PG超排处理(黄体数17.11个/只,可用胚胎数10.38枚/只)(P<0.01).[结论]新疆细毛羊超数排卵时宜选用2.0周岁以上的供体羊,FSH剂量控制在150~200 U/只,若能与PG联合使用其超排效果更好,但不宜与PMSG联合使用.     

不同药物处理方法对绵羊超数排卵的影响

针对不同激素和方法对绵羊超数排卵效果的影响进行研究,结果表明,FSH法和PMSG法可移胚数分别为93(7.75)和21(1.75),差异显著;FSH减量法和恒量法的黄体数分别为148(12.33)和112(9.33),回收卵数分别为133(11.08)和63(5.25),可移胚数分别80(6.67)和63(5.25).FSH超数排卵效果优于PMSG,FSH减量法优于FSH恒量法.运用FSH减量法不但可增加黄体数量,还可增加可移胚的数量.     

抑制素主动免疫对母牛卵泡发育的影响

本试验以猪精液抑制素粗提物主动免疫母牛,研究了对母牛卵泡发育和内分泌的影响。免疫,母牛的卵泡发育率为１４５．５％,排卵率为１１８．２％,分别比对照组提高４５．５％和１８．２％。通过放射免疫法对免疫牛血液中ＦＳＨ,ＬＨ,Ｅ２水平测定发现,发情时免疫组母牛ＦＳＨ水平高于对照组,免疫组中多卵发育牛ＦＳＨ水平高于单卵牛,免疫组与对照组中ＬＨ水平相差不大,多卵牛发情时Ｅ２水平较高。     

Endocrine and ovarian responses in water buffalo cows immunized against inhibin and subjected to the Ovsynch protocol

The aim of this study was to investigate the feasibility of stimulating ovarian follicle development in order to improve fertility in water buffalo cows by immunization against inhibin. The experiment was carried out in early summer(May) and included 24 multi-parity crossbred Murrah-Swamp buffaloes that were divided into immunized(n=11) and control(n=13) groups. Each immunized cow was administered with a 2-m L immunogen of mineral oil adjuvant containing 2 mg of recombinant inhibin α-subunit fusion protein. The controls were treated with the adjuvant only. All animals received Ovsynch protocol treatment, starting on the day of the antigen administration, and they were artificially inseminated upon behavioral estrus. As a result, all of the immunized buffaloes generated antibodies against inhibin during the experimental period and had higher plasma concentrations of follicle-stimulating hormone(FSH), activin, and estradiol(E2) related to estrous expression. A higher proportion of immunized animals expressed estrus behavior than did the controls(72% vs. 30%, P0.05). On average, inhibin-immunized buffaloes had significantly more large follicles(≥9 mm in diameter) than the controls(mean±SEM; 1.2±0.1 vs. 0.84±0.1, respectively; P0.05) and a slightly higher mean total number of follicles(≥2 mm; 11.4±0.7 vs. 9.0±1.1, respectively; P=0.09) and small(2–4 mm) follicles(8.81±0.6 vs. 6.84±1.0, respectively; P=0.12). A higher percentage of cows ovulated in the immunized group than in the control group(91%(10/11) vs. 54%(7/13), respectively; P0.05). Moreover, inhibin-immunized cows had slightly larger corpus luteum(CL) than the controls 9 days after ovulation and significantly higher(P0.01) post-ovulation peak plasma progesterone(P4) concentrations. Immunization against inhibin also marginally increased the conception rate 42 days after insemination(45.8% vs. 15.4%; P0.05). These results demonstrate that immunization against inhibin, coupled with the treatment with the Ovsynch protocol, can constitute a new technique to increase fertility in water buffalo cows.