马杜霉素对不同虫株柔嫩艾美耳球虫超微结构的影响

鸡体内用5mg/kg马杜霉素作用于柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)敏感虫株和抗药虫株，比较裂殖生殖阶段超微结构的差异。敏感株型裂殖体体积变小，所生成裂殖子的数目变小，裂殖子膨胀，裂殖子间（带虫空泡内）微管膨胀，结构模糊，有髓鞘样结构出现；限制膜外突和细胞质分离形成空隙，膜结构模糊，有破损；细胞浆空泡化，出现附加体和髓鞘样结构；少数细胞核的外膜外突和内膜分离，有的部位的核膜模糊、破损。首次发现裂殖子顶体结构发生异常变化，棒状体消失，微线数目减少或者消失；线粒体表现为形态改变，嵴脱落，内部形成空泡、膜状结构和髓鞘样结构，线粒体的嵴与长辆平行排列，且贯穿线粒体。抗药虫株没有发现异常变化。推理抗生素类抗球虫药的作用机理为破坏虫体结构和抑制虫体的生理机能两个方面；球虫对该类药物产生抗药性的机制是基因突变和药物选择的结果。     

柔嫩艾美耳球虫2个抗药株的抗药性评估

为检测实验室长期保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株的遗传稳定性,采用鸡体试验法,以抗球虫指数、最适抗球虫活性百分率、病变记分减少率和相对卵囊产量4项指标,评价2个抗药株对地克珠利、癸氧喹酯、马杜拉霉素等3种抗球虫药物的抗药性,并以柔嫩艾美耳球虫敏感株为对照。结果显示,柔嫩艾美耳球虫敏感株对3种抗球虫药物均无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株对马杜拉霉素为完全耐药,4项指标全部阳性;对地克珠利、癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株对地克珠利表现为完全耐药,4项指标全部阳性;对马杜拉霉素表现为中度耐药,2项指标阳性;对癸氧喹酯则表现为无抗药性,4项指标全部阴性。结果表明,在实验室已繁殖保存10余年的柔嫩艾美耳球虫2个抗药虫株对其诱导药物具有明显抗药性,实验室保种繁殖方法可行,虫株遗传稳定性良好,为利用该虫株进行球虫抗药性机制等相关研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫对四种抗球虫药的交叉抗药性试验

为了测试柔嫩艾美耳球虫的４种抗药虫株（抗地克珠利、抗拉沙里菌素、抗盐霉素和抗克球粉虫株）对４种抗球虫药（地克珠利、拉沙里菌素、盐霉素和克球粉）的敏感性进行了本试验。结果表明：柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药虫株对拉沙里菌素、盐霉素和克球粉均表现敏感,拉沙里菌素抗药虫株、盐霉素抗药虫株和克球粉抗药虫株对地克珠利也表现为高度敏感,因此,柔嫩艾美耳球虫对地克珠利与拉沙里菌素、地克珠利与盐霉素、地克珠利与克球粉３组药物不存在交叉抗药性。     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

不同来源柔嫩艾美耳球虫虫株微线体3基因的克隆和序列分析

以8株不同来源柔嫩艾美耳球虫分离株为研究对象,对其艾美耳球虫微线体3(Eimeria tenella microneme protein,EtMIC3)基因进行了RT-PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的柔嫩艾美尔球虫相关序列进行比较,研究EtMIC3基因遗传变异情况。结果获得2976 bp的目的片段,各株与FJ374765.1 CDs的序列相似性在99.8%~99.9%之间,各株之间的序列相似性为99.9%~100.0%,各株编码的氨基酸序列与GenBank登记的柔嫩艾美耳球虫EtMIC3蛋白(ACJ11219)相似性在99.6%~99.9%之间,不同地理来源或耐药性虫株之间没有明显差异。本研究首次对中国EtMIC3基因进行了序列分析,结果显示不同来源株EtMIC3基因高度保守,为有效的疫苗候选因子,为进一步进行柔嫩艾美耳球虫基因工程疫苗构建的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫江苏株微线蛋白-3基因的克隆与序列分析

柔嫩艾美耳球虫微线蛋白-3(EtMIC3)不仅在虫体侵入中起关键作用,而且还决定了球虫侵入部位特异性。为克隆柔嫩艾美耳球虫江苏株的EtMIC3基因,根据GenBank上登录的EtMIC3基因序列设计特异性引物,以子孢子总RNA为模板,用RT-PCR的方法扩增EtMIC3的cDNA序列,将其与pMD19-T连接后送至上海英骏生物技术有限公司测序并进行序列分析。结果表明EtMIC3的开放阅读框(ORF)为2 967 bp,编码988个氨基酸,与GenBank上的EtMIC3基因(登录号:FJ374765.1)比较,核苷酸同源性为99%,推导的氨基酸序列同源性为99%。本研究为揭示柔嫩艾美耳球虫入侵和寄生部位特异性的分子机制提供基础,也为柔嫩艾美耳球虫新型疫苗的研制提供候选抗原。     

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

2株柔嫩艾美耳球虫对5种抗球虫药的抗药性

选择130只21日龄雏鸡，研究了柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)南京株和凤阳株对地克珠利（Diclazuril)、马杜霉毒（Maduramicin)、氯羟吡啶（Clopidol)、氯苯胍（Robenidine)和氨丙啉（Amprolium)的抗药性。试验鸡随机分成13组，其中每株球虫均设5个感染用药组，1个感染不用药组，另设1个不感染不用药组，每组10只鸡。以POAA，RLS，ROP，ACI作为指标。结果表明，2株柔嫩艾美耳球虫均对氨丙啉轻度抗药，对地克珠利敏感或轻度抗药，对氯羟吡啶中度抗药。对马杜霉和氯苯胍中度抗药或安全抗药。提示：目前在凤阳地区可合理地使用地克珠利和氨丙啉，对氯羟哟啶应慎用，对马杜霉素和氯苯胍须减少或暂停使用。     

柔嫩艾美耳球虫河北株致病性检测及ITS-1基因序列分析

为分析鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)河北株的致病性及其ITS-1基因序列遗传变异特点,对临床分离的柔嫩艾美耳球虫河北株通过人工感染雏鸡试验验证其致病性,并计算其半数致死量(LD_(50)),采用RT-PCR对柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因进行扩增、克隆,测序后进行生物信息学分析其基因序列变异情况。结果显示:柔嫩艾美耳球虫河北株对雏鸡有较强的致病性,其LD_(50)为3.16×10~4个/只;柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因与GenBank登录的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株的相似性在97.7%～99.0%之间,系统发育进化树分析显示柔嫩艾美耳球虫河北株与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株和柔嫩艾美耳球虫上海株聚为一支,亲缘性最近,与其它虫株亲缘性较远;与GenBank发表的柔嫩艾美耳球虫ETSH4PF3-17株序列相比,柔嫩艾美耳球虫河北株的ITS-1基因序列中在第4、13、16、425位4个碱基发生缺失;第258、348位2个碱基发生变异,由C变为T,由G变为T。研究结果为进一步研究柔嫩艾美耳球虫河北株遗传变异情况提供参考依据。     

球虫抗药性分子生物学检测技术的建立

选择在敏感虫株中沉默、抗药虫株中表达的特异序列AGD5设计检测引物，采用RT—PCR方法。以总RNA反转录的cDNA为模板，RT—PCR方法能够鉴别马杜霉素抗药虫株和3株马杜霉素敏感虫株（2株对所有药物敏感的不同地理株，1株地克珠利抗药性虫株对马杜霉素敏感），此鉴定结果与鸡体试验的结果一致，说明敏感虫株和抗药虫株在该序列上的差异发生在转录水平。而以卵囊总DNA为模板的PCR方法不能鉴别敏感和马杜霉素抗药性虫株。     

Vaccination of chickens with a chimeric DNA vaccine encoding Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 induces protective immunity against coccidiosis

A fusion DNA vaccine co-expressed Eimeria tenella TA4 and chicken IL-2 (chIL-2) was constructed and its efficacy against E. tenella challenge was observed. TA4 gene of E. tenella and chIL-2 gene were cloned into expression vector pcDNA3.1 and pcDNA4.0c in different forms, producing vaccines pcDNA3.1-TA4-IL-2, pcDNA3.1-TA4 and pcDNA4.0c-IL-2. The expression of aim genes in vivo was detected by RT-PCR and western blot. Animal experiment was carried out to evaluate the immune efficacy of the vaccines. Results indicated these DNA vaccines were successfully constructed and the antigen genes could be expressed effectively in vivo. The animal experimental results showed that DNA vaccines could obviously alleviate cecal lesions, body weight loss and increase oocyst decrease ratio. The ACI of pcDNA3.0-TA4-IL-2 group was 192, higher than that of pcDNA3.1-TA4 group. The results suggested that TA4 was an effective candidate antigen for vaccine and co-expression of cytokine with antigen was an alternative method to enhance DNA vaccine immunity.     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原（EtSAG）基因的分离及鉴定

利用本实验室前期获得的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）孢子化卵囊和未孢子化卵囊差异表达ESTs序列,选取编号为BW4-C03的孢子化卵囊,采用RACE技术,获得该基因全长序列。经BLAST分析,该序列与柔嫩艾美耳球虫表面抗原有72%以上的同源性,命名为EtSAG。利用荧光定量PCR（Real-time PCR）检测发现该基因在孢子化卵囊的转录拷贝数最高,且随着孢子化时间的延长,转录拷贝数逐渐增加。采用原核表达载体pET-28C表达该基因,得到的融合蛋白大小约为36 kDa,符合预期大小。经Western blot分析,该重组蛋白可被兔抗柔嫩艾美耳球虫的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。本研究结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

鸡艾美耳球虫18SrDNA序列与系统进化分析

为了确定鸡艾美耳球虫（Eimeria）不同种以及来自不同地区同种不同株之间的亲缘关系,研究其分类地位,对实验室保藏的柔嫩艾美耳球虫（Etenella）、毒害艾美耳球虫（Eneeatrix）、巨型艾美耳球虫（Emaxima）、堆形艾美耳球虫（Eaaervulina）等4种15株鸡球虫孢子化卵囊的18SrDNA基因进行克隆、测序,并与从GenBank下载的鸡球虫18SrDNA序列一起,使用软件DNAstar 5．0 MegAlign进行系统发育分析。结果显示,4种艾美耳球虫种间同源性在94．6％～99．4％之间,7株柔嫩艾美耳球虫的株间同源性在99．0％-99．9％之间,5株巨型艾美耳球虫的株间同源性在96．9％～99．8％之间。用该4种鸡球虫的18SrDNA序列与GenBank下载的另外4种鸡球虫18SrDNA序列构建系统发育树,显示这8种鸡艾美耳球虫形成2个分支,即堆形艾美耳球虫（EASH）、巨型艾美耳球虫（EMSH）、变位艾美耳球虫（Emivati）、和缓艾美耳球虫（Emitis）、布氏艾美耳球虫（Ebrunetti）、早熟艾美耳球虫（Epraecox）构成1个分支,柔嫩艾美耳球虫（ENSH）、毒害艾美耳球虫（ETAS）构成另1分支。巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫各株的系统发育树均根据地域关系产生2个分支。柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫的亲缘关系较近,不同地理区域的同种不同株的亲缘关系相对较远,种间和种内的鉴定结果与普通生物学结果一致。本研究提示18SrDNA基因可用于鸡球虫不同种／株的分类鉴定,为艾美耳球虫分子遗传学鉴定提供了理论基础。     

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2的酵母表面展示

利用酿酒酵母表面展示系统展示柔娥艾美耳球虫微线蛋白基因EtMIC2,为下一步研制活裁体疫苗奠定基础。参照GenBank中柔嫩艾美耳球虫EtMIC2基因序列设计引物,以柔嫩艾美耳球虫的RNA为模板,利用RT—PCR扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到酿酒酵母表面展示的载体pCTCON2,转化大肠杆菌TOPl0,提取阳性质粒转化酿酒酵母菌株EBYl00,诱导表达后,用抗EtMIC2蛋白质特异性抗体,做间接免疫荧光（IFA）检测EtMIC2蛋白的表达。结果显示,EtMIC2成功展示到酵母细胞表面,测得最佳诱导时间为48h。     

紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析

为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术（SSH）筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因（Unigenes）,其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因的原核表达及动物免疫试验

为了研究鸡柔嫩艾美耳球虫SO7基因原核表达重组蛋白的免疫效力,分析其在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中对鸡平均增重、抗球虫指数(ACI)、减少盲肠病变和卵囊数量中的作用,从柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊中提取总RNA作为模板,用RT-PCR扩增出SO7基因片段,再应用DNA重组技术将SO7基因克隆到原核表达载体pET32a(+)中并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pET32a(+)-SO7表达的目的蛋白约为40ku,主要以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白进行动物免疫试验显示,SO7重组蛋白在鸡抗柔嫩艾美耳球虫感染中有较好的免疫保护作用,能够显著提高鸡柔嫩艾美耳球虫感染鸡的平均增重和抗球虫指数(ACI),对减少盲肠病变和卵囊数量也有部分作用。