金黄色葡萄球菌β溶血素研究进展

金黄色葡萄球菌β溶血素是一种具有磷脂酶C活性的外毒素,具有白细胞毒性、溶血活性等特征,并且对奶牛乳房炎也具有一定的致病性。因此,β溶血素在免疫预防和细胞生物学领域的研究具有很大的价值。对其理化性质与细胞膜作用机制进行介绍,对其毒力、致病性等最新研究进展进行综述。     

牛源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药敏试验

研究金黄色葡萄球菌的耐药性状况,指导兽医临床用药。采用高盐甘露醇进行纯化培养,梅里埃全自动微生物分析系统对葡萄球菌鉴定板进行鉴定,纸片扩散法进行药敏实验。从阳性乳房炎样品中分离纯化并鉴定了样品中的金黄色葡萄球菌2株,测定了其耐药性。在选取的5种药物中,青霉素对分离病原菌的抗菌活性较高,其次是恩诺沙星和庆大霉素,而链霉素和磺胺嘧啶钠对分离病菌的抗菌活性较低。     

牛源抗金黄色葡萄球菌α溶血素单链抗体研制

由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎给养殖业造成了严重损失,抗生素是治疗奶牛乳腺炎的首选方法,但易出现耐药菌株。而目前针对金黄色葡萄球菌的疫苗也不能对奶牛乳腺炎提供足够的保护,疫苗的主要作用机理是激发机体产生抗体,故被动免疫针对金黄色葡萄球菌毒力因子的抗体也许能对感染起到一定的治疗作用。本研究首先扩增得到影响其致病性的重要毒力因子-α溶血素(Hla)的编码基因,然后将其转化到E.coli中进行表达并纯化,再以此纯化产物为抗原,从牛源噬菌体单链抗体表达文库中筛选到了一株针对α溶血素(Hla)高亲和力的scFv,最终将该scFv进行纯化。本研究一方面为治疗金黄色葡萄球菌所致奶牛乳腺炎提供一种新思路,另一方面也为分子水平上研究α溶血素的致病机制提供了有效的阻断分子。     

牛源金黄色葡萄球菌α溶血素单链抗体对小鼠乳腺的保护作用

为探究治疗奶牛乳腺炎的抗生素替代性生物制剂,研究将前期获得的特异性针对金黄色葡萄球菌毒力因子α溶血素的单链抗体scFvZZ107,在小鼠感染金黄色葡萄球菌乳腺炎模型中验证其保护作用。结果显示,3种不同剂量(5、10、15 μg)单链抗体处理组乳腺组织内细菌数量分别为25.42±1.3、3.33±0.53和4.8±0.78 lgcfu/mg,IL-1α的含量分别为49±7.91、31.37±2.26和57.34±4.48 pg/mL,IL-1β含量分别为40.91±7.39、47.81±4.78和39.2±2.28 pg/mL,IL-8的含量分别为48.64±1.86、41.65±3.07和45.74±1.56 pg/mL,与生理盐水处理组相比,单链抗体中、高剂量处理组乳腺内金黄色葡萄球菌检出量显著减少(P<0.05),且IL-1α、IL-1β与IL-8的含量均显著降低(P<0.05)。通过观察小鼠乳腺组织HE和TUNEL染色情况,与生理盐水处理组相比,scFv中、高剂量处理组乳腺组织更加完整,凋亡细胞的数量也更少,表明scFvZZ107对小鼠乳腺具有良好的保护作用。     

新疆牛源金黄色葡萄球菌抗菌素敏感性调查

[目的]了解新疆奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的药物敏感性情况,为该病治疗的临床用药提供参考。[方法]2009年以来对乌鲁木齐市、昌吉、呼图壁、奎屯、伊犁和库尔勒6地区16个奶牛养殖场乳房炎奶样分离金黄色葡萄球菌,用纸片扩散法进行抗菌素敏感性检测。[结果]共分离143株金黄色葡萄球菌,临床药敏试验显示,新疆70%以上分离株对红霉素、青霉素、复方新诺明、多西环素、四环素耐药,40%的菌株对氯霉素、环丙沙星和庆大霉素耐药;并且67.1%菌株同时对5种以上抗菌素耐药,10.5%的菌株对所测试的10种抗菌素耐药。此外,发现了19.6%的牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。[结论]新疆奶牛乳房炎病例中的金黄色葡萄球菌对当前临床上允许使用的多种类型的抗菌素呈现严重的多重耐药,使用抗菌素进行奶牛乳房炎的防治难以取得理想的疗效。这类菌株的存在和蔓延将对新疆奶牛养殖业的健康发展和奶制品的安全构成威胁,建议在选择奶牛乳房炎治疗的抗生素时,应以流行菌株的耐药性为依据。     

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。     

牛金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的金黄色葡萄球菌β-溶血素基因序列,设计了一对特异性引物。提取临床乳腺炎致病性金黄色葡萄球菌山东株zfb的全基因组DNA为PCR模板,扩增β-溶血素基因,将PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体中。测序结果表明,扩增片断含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸和1个终止子的成熟蛋白,与已报道的金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白的氨基酸组成同源性为99.4%。软件分析显示,克隆的金葡菌β-溶血素是一种依赖于金属离子的磷脂酶。上述结果显示,已获得金黄色葡萄球菌β-溶血素基因,为获得重组金黄色葡萄球菌β-溶血素蛋白及对其结构和功能的研究奠定了基础。     

鹅金黄色葡萄球菌的分离及鉴定

从采自死亡肉鹅肝和脾病料中分离到一株细菌，经细菌形态学观察，鉴别培养，梅里埃微生物全自动分析仪检验，血浆凝固酶试验鉴定为金黄色葡萄球菌。该分离菌株对小白鼠有致病性，动物回归试验中，能使雏鹅发病并全部死亡。从而证明本病的病原为致病性金黄色葡萄球菌。药敏试验结果表明，该菌株对环丙沙星、先锋V、毒霉素和氨苄青霉素高度敏感，而对复方新诺明不敏感。     

牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株（zfb）β-溶血素(hlb)的克隆、表达及溶血活性分析

 【目的】实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性。【方法】PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应。【结果】测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU?mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103 HU?mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应。【结论】成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础。此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法。     

牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株(zfb)β-溶血素(h/b)的克隆、表达及溶血活性分析

[目的]实现牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素在大肠杆菌中的高效表达,并分析重组β-溶血素的溶血活性.[方法]PCR扩增牛乳中金黄色葡萄球菌山东分离株β-溶血素基因,构建原核表达载体pET32a+/hlb,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用96孔血凝板测定重组蛋白的溶血效价,以血琼脂平板法检测重组蛋白的CAMP反应.[结果]测序结果表明,扩增片段含有993 bp的ORF,可编码含330个氨基酸的成熟蛋白;SDS-PAGE分析重组蛋白表达水平,IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为57 kD,表达量占菌体总蛋白的23.9%;溶血效价分析,金葡菌β-溶血素对绵羊红细胞的溶血效价为278 HU·mg-1,对奶牛红细胞的溶血效价为9×103Hu·mg-1;重组蛋白在血琼脂平板上和无乳链球菌能发生明显的CAMP反应.[结论]成功表达了牛乳中金黄色葡萄球菌β-溶血素,该毒素对奶牛红细胞的溶血活性明显大于绵羊红细胞,显示出牛源金黄色葡萄球菌β-溶血素的特性明显不同于人源金黄色葡萄球菌β-溶血素,为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了理论基础.此外,重组蛋白还可用来特异性诊断、鉴别无乳链球菌,为兽医临床诊断提供新的方法.     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌凝固酶基因型研究

 【目的】了解上海和贵州地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌凝固酶基因型情况,为奶牛乳房炎的防治提供理论依据。【方法】利用16S rRNA保守序列设计引物,PCR扩增鉴定金黄色葡萄球菌,并利用凝固酶基因及其酶切产物多态性对分离鉴定出的金黄色葡萄球菌进行了凝固酶基因分型。【结果】共鉴定出78株金黄色葡萄球菌,有74株金黄色葡萄球菌扩增凝固酶基因片段,分为5个基因型和两个亚型。PCR 1型为贵州地区优势基因型,PCR 3型为上海地区优势基因型。【结论】两地区各基因型菌株分布比例有显著的地域性差异,这与两地区地理环境和养殖水平差异对病原流行传播的影响有关。     

奶牛乳房炎源性金黄色葡萄球菌分离株N_2的耐药性分析及其基因特征

以乳房炎源性金黄色葡萄球菌分离株N2为研究对象,采用纸片扩散法分析了耐药性,应用刚果红法检测了生物被膜形成能力,利用PCR法扩增了8种生物被膜形成基因和9种肠毒素基因。结果表明,金黄色葡萄球菌分离株N2具有广泛的耐药性,仅对苯唑西林高度敏感,具有较强的生物被膜形成能力,携带除bap外所有的被测生物被膜相关基因和sea、sec、seg、sei 4种肠毒素基因。结果表示金黄色葡萄球菌分离株N2可能存在多种侵袭方式,在临床上难以防治,为进一步以该菌株为研究材料进行相关研究奠定了基础。     

奶牛金黄色葡萄球菌乳腺炎及其疫苗的研究进展

金黄色葡萄球菌是奶牛乳腺炎的重要致病菌,笔者对奶牛乳腺炎、金黄色葡萄球菌及其致病机理、金黄色葡萄球菌乳腺炎疫苗的研究等进行了综述,并对新型疫苗的研究进行了展望。     

甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响

【目的】探讨甘草甜素对金葡菌所致小鼠乳腺炎控制效果;【方法】30只BALB/C雌孕鼠随机分成正常对照组(Con,n=10)、阳性对照组(P,n=10)和试验组(T,n=10)。阳性对照组和试验组母鼠于产后8～10d经乳头管注入50μl 7.0×102CFU细菌悬液,生理盐水组注入50μl灭菌生理盐水。30只母鼠于接菌-12h、0h、12h、36h腹腔注射甘草甜素88mg/kg或生理盐水0.2ml。接菌后66h处死小鼠,取乳腺组织固定,进行组织学观察;【结果】观察显示P组的小鼠乳腺组织破坏得最为严重。P组小鼠乳腺组织间质宽度与正常对照组相比极显著增加(p<0.01),T组小鼠乳腺组织间质宽度极显著高于正常对照组(p<0.01),与P组相比极显著减少(p<0.01);与正常对照组相比,P组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量极显著升高(p<0.01),T组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量与P组相比极显著降低(p<0.01)。【结论】结果表明,甘草甜素不仅减少乳腺内的细菌数,降低对组织的损伤,而且减轻乳腺炎症变化及全身反应,对乳腺具有一定的保护作用。     

山东省牛源金黄色葡萄球菌耐药谱分析及mecA耐药基因检测

采用纸片扩散法测定金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)对6种抗生素的敏感性。结果表明,在测定的121株金葡菌中,耐苯唑西林金葡菌(MRSA)为26株,占21.5%;对苯唑西林敏感菌(MSSA)为93株,占76.9%;中介菌株为2株,占1.6%。金葡菌对6种抗生素耐药率最低的是头孢噻肟为2株,占1.6%。mecA基因的PCR扩增结果显示:所有的MSSA mecA基因均阴性,中介株mecA基因阳性1株,而MRSA中mecA基因阳性株为9株。MSSA对大部分抗生素仍保持良好的敏感性,而MRSA表现为多重耐药性,PCR技术可以作为快速检测金葡菌耐药基因的有效方法。     

重组溶葡萄球菌酶对金葡菌诱导试验性小鼠乳腺炎的防治研究

试验采用重组溶葡萄球菌酶探讨了对小鼠试验性乳腺炎的治疗效果.利用微量肉汤稀释法测定了重组溶葡萄球菌酶时乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC).将18只泌乳8～10 d的BALB/C母鼠随机分成正常组、阳性对照组和试验组.阳性时照组和试验组母鼠经第4对、第5对乳腺乳头管注入50μL 2.0x105CFU的细菌悬液.试验组攻菌出现症状后,每个乳腺经乳头管注入1 U·mL-1的重组溶葡萄球菌酶稀释液50μL,间隔12 h 1次.观察小鼠的临床症状,测定体温、血常规等指标.接菌66h后,颈静脉放血处死小鼠,取小鼠乳腺进行细菌计数和病理组织切片制作.结果显示,重组溶葡萄球菌酶对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.001 U·mL-1,MBC值为0.063U·mL-1.病理组织观察显示,正常组的腺泡结构完整,而阳性对照组的乳腺组织局部被破坏,间质增宽,炎性细胞浸润严重,试验组的组织结构基本正常,有轻度充血.说明重组溶葡萄球菌酶能有效地减少细菌感染,降低组织的损伤程度,对乳腺有一定地保护作用.     

奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌基因工程疫苗研究进展

针对金黄色葡萄球菌易引起奶牛乳房炎的问题,综述了金黄色葡萄球菌表面蛋白的种类及其在基因工程疫苗研制方面的进展。试验表明,其主要通过其表面蛋白(黏附素)与宿主的细胞外基质结合感染宿主,研究金黄色葡萄球菌黏附素对预防由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有广阔的前景。     

泰安郊区肉鸡金黄色葡萄球菌耐药性分析

对肉鸡金黄色葡萄球菌耐药性进行分析,结果表明,该菌株对中药黄连和抗生素头孢唑啉、替米考星药敏纸片表现为极度敏感;对中药黄芩、大青叶和抗生素恩诺沙星、氯雾素、卡那霉素、痢特灵药敏纸片高度敏感;对链霉素和环丙沙星药敏纸片中度敏感;对板蓝根、四环素、庆大霉素以及白头翁、红霉素、青霉素等表现为低度敏感或耐药。