急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co²⁺柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg²⁺可以增强其活性。     

仿刺参补体AjC3部分基因的原核表达及多克隆抗体的制备

通过制备仿刺参补体C3(AjC3)多克隆抗体,为进一步研究仿刺参补体AjC3免疫机制奠定基础。利用PCR技术扩增AjC3部分基因片段(4556~5110bp),将该片段与原核表达载体pGS-21a连接。将重组表达质粒转化到Transetta(DE3)中经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍柱纯化后,作为抗原免疫小鼠制备AjC3多克隆抗体。分别用间接ELISA,Western blot检测抗体的效价和特异性。结果显示,PCR扩增得到约555bp的目的片段,重组蛋白分子量大小约56ku;间接ELISA检测抗体效价达1∶25600,Western blot结果显示,多克隆抗体具有良好的特异性。该试验成功的制备了补体AjC3多克隆抗体,为补体AjC3的进一步研究提供了检测工具。     

鲑鱼甲病毒E1基因高保守区融合表达及免疫特性的分析

根据Gen Bank中公布的鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三个基因型中E1基因,选择高保守序列702 bp(436-1137)合成基因,命名为SAV E1,将其克隆到原核表达载体p Cold TF中构建重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达,SDSPAGE和Western blot鉴定,重组蛋白均获得了表达,表达E1重组蛋白约95 k D。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,制备抗血清。间接ELISA结果显示,鼠抗重组蛋白E1血清效价为1∶25 600;间接免疫荧光结果显示,鼠抗重组E1蛋白血清可与SAV发生特异反应,由此表明表达的E1重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为SAV检测方法的建立提供理论依据。     

哲罗鱼胰岛素样生长因子-II的原核表达与活性分析

在鱼类胚胎发育过程中,胰岛素样生长因子-II(insulin-like growth factors-II,IGF-II)起着关键的作用。本研究根据Gen Bank收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物,以哲罗鱼(Hucho taimen)肝RNA提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框。将目的基因IGF-II与原核表达载体p SUMO连接构建出重组表达载体p SUMO-IGF。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,约在40 k D处含有清晰的条带,与预期结果相符;目的蛋白以包涵体形式存在。对包涵体进行变性/复性后获得较纯的目的蛋白,利用ELISA和MTT方法对目的蛋白进行免疫学活性及生物学活性分析。ELISA结果显示该目的蛋白能够与商品化的抗鲑鳟鱼IGF-II的抗体发生特异性反应,并且呈现抗原浓度依赖性,该结果说明本研究获得了具有良好免疫原性的IGF-II蛋白;MTT方法测定IGF-II蛋白对鲤(Cyprinus carpio)上皮细胞(epitheliaoma papulosum cyprini,EPC)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)性腺细胞(rainbow trout gonad,RTG-2)的增殖效果来鉴定IGF-II蛋白的生物学活性,结果显示所表达的哲罗鱼IGF-II蛋白能够有效的刺激EPC细胞和RTG-2细胞增殖。该结果表明利用原核表达系统获得的哲罗鱼IGF-II蛋白具有良好的生物学活性。本研究为哲罗鱼的生长模式和生长繁殖的研究奠定了基础。     

三疣梭子蟹C-型凝集素的原核表达和活性检测

通过RT-PCR扩增三疣梭子蟹C-型凝集素（C-type lectin like-domain protein,CTLD）基因序列,将目的基因克隆入质粒pET32a,构建原核表达重组质粒pET32a-CTLD.将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导CTLD的表达,对其表达产物进行SDS-PAGE和Western blot 检测.用His GraviTrap Ni亲和层析柱及超滤离心管纯化目的蛋白,并对其进行活性检验.结果表明,构建得到CTLD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;诱导表达出相对分子质量（M） 39 600的目的蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测,融合蛋白成功表达;重组C-型凝集素对兔的红细胞没有明显的凝集作用,但对小鼠红细胞的凝集效价是22,而对所选5种细菌的凝集作用存在差异,其中对大肠杆菌具有明显的凝集作用,而对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌均无凝集现象.本研究结果为进一步研究C-型凝集素在免疫防御中的作用与地位提供依据.     

刺激隐核虫钙调蛋白基因的分子鉴定

为了解钙调蛋白在刺激隐核虫生长发育过程中的作用，实验从刺激隐核虫滋养体cDNA 文库中克隆出钙调蛋白基因 （cicam），优化密码子后人工合成开放阅读框 （ORF），构建成重组质粒 pGEX-4T-1/cicam，将其转化至大肠杆菌后，通过 ZYM-5052 自诱导培养基诱导重组子表达。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶及凝血酶纯化重组蛋白 rCiCaM，并用其免疫小鼠 BALB/c 株获得多克隆抗体。分别用逆转录 PCR 和免疫印迹实验检测 cicam 及其编码蛋白 CiCaM 在各期虫体中的表达。通过间接荧光抗体实验检测 CiCaM 在幼虫中的定位。通过覆盖印迹实验 （Blot overlay assay） 初步探讨了重组蛋白 rCiCaM 结合重组肌动蛋白解聚因子的活性。结果显示，cicam 的 ORF 为 450 bp，编码含 149 个氨基酸的肽链，其分子量预测值为 16.9 ku；原核表达的融合蛋白 GST-rCiCaM 及切除 GST 标签的 rCiCaM 的表观分子量分别为 43 和 16.9 ku，均与预测值相符；cicam 在刺激隐核虫的各个发育阶段都有稳定的表达，其表达产物 C...     

中华绒螯蟹FAD6-b基因的全长克隆及原核表达分析

根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。     

病毒性出血性败血症病毒单链抗体的原核表达及其功能鉴定

为制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)单链抗体(single chain variable fragment antibody,ScFv)并鉴定其生物学功能,本研究提取抗VHSV单抗1G5的杂交瘤细胞株总RNA并反转录获得cDNA模板,通过PCR扩增VHSV抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)编码序列,将其拼接成单链抗体Sc Fv基因后插入载体pET28a中,构建原核表达重组质粒并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明,单链抗体主要以可溶性形式表达,分子量约28 ku,能特异性识别VHSV病毒的G蛋白并对VHSV病毒具有体外中和活性,其对VHSV病毒的G蛋白亲和力(KD)达到1.4×10~(–8) M。单链抗体ScFv的制备为进一步研究VHSV的治疗性抗体、快速诊断试剂奠定了基础。     

罗非鱼HSP70(tHSP70)蛋白的生物信息学分析、真核表达及质谱鉴定

运用生物信息学技术分析罗非鱼热休克蛋白70(tilapia heat shock protein,tHSP70)的理化特性、糖基化位点、跨膜区域、蛋白的细胞定位及信号肽与虹鳟等其他动物HSP70的相似性,以人工合成cDNA为模板,通过聚合酶链式反应扩增其完整CDS,并将此DNA片段与真核表达载体pGAPZa-A连接,构建pGAPZa-HSP70表达质粒,在毕赤酵母GS115中表达tHSP70蛋白,对表达上清液进行SDS-PAGE及Western-blotting分析后,采用Ni²⁺IDA层析脱盐纯化目的蛋白,并对所表达的蛋白进行糖基化PAS染色鉴定。对表达的蛋白进行SDS-PAGE后,将所获得的非预定大小(约100 ku)条带进行电离飞行时间质谱鉴定,并确定其蛋白种类。结果表明:tHSP70所含氨基酸数量为640,分子量为70 274.5 u,等电点为5.49。在哺乳动物网织红细胞(体外)的半衰期为30 h,在酵母内半衰期大于20 h,而在大肠杆菌内的半衰期也大于10 h,不稳定指数为36.64,脂肪族指数为85.58。可能分别含有6个N-和O-糖基化位点,所克隆tHSP70基因与目的基因完整编码区序列完全一致,所构建的pGAPZa-HSP70质粒能在GS115中成功表达,诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western-blotting分析后发现,除70 ku目的蛋白外,还出现一条100 ku条带。经糖基化PAS染色证明,此100 ku蛋白可能是HSP70糖基化的结果,且能被人的兔抗HSP70抗体识别,质谱鉴定证明该条带即是tHSP70蛋白。本研究所表达tHSP70蛋白为后续罗非鱼细胞学及抗原提呈等免疫学研究奠定了基础。     

盘鲍原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫原性鉴定

为获得具有过敏原活性的重组盘鲍TM进行了试验。克隆盘鲍原肌球蛋白(tropomyosin,TM)基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行了鉴定。从盘鲍肌肉中提取总RNA,RT-PCR克隆盘鲍中原肌球蛋白基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增盘鲍TM的开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化入大肠杆菌Escherichia.coli BL21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,West-ern-blot检测其免疫学活性。经序列测定,该基因由855个碱基组成,编码284个氨基酸。SDS-PAGE检测该重组蛋白在大肠杆菌中高效表达38 kD的目的蛋白,且重组蛋白具有良好的IgE结合活性。     

大连刺参体腔液甘露糖结合凝集素序列的鉴定及分析

根据NCBI提交的刺参体腔液(Apostichopus japonicus)甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectins,MBLs)序列(AY625513)设计引物,抽取刺参体腔液进行总RNA提取,采用RT-PCR技术,获得498 bp目的片段。通过克隆、测序确定得到刺参MBLs序列。将得到序列进行核苷酸和氨基酸序列比对,鉴定了大连刺参MBLs序列,并为我国不同区域刺参的进一步分类提供了科学的分子水平依据。     

仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析

表皮生长因子受体(EGFR)是多种细胞因子的受体,在细胞增殖、迁移及分化中具有重要的作用。应用RACE法首次从仿刺参体腔细胞中克隆出EGFR基因的全长cDNA序列。该cDNA全长3 826 bp,包括821 bp的5’-UTR,281 bp的3’-UTR,开放阅读框2 724 bp,编码907个氨基酸。推导的氨基酸序列55-184aa和365-487aa符合EGFR基因所具有的L1和L2受体结构域,在203-344aa和503-823aa含有EGFR家族特征区域CR1和CR2半胱氨酸富集区,并同为跨膜糖蛋白,在结构上具有一致性。经BlastP与GenBank已知物种氨基酸序列进行同源性比对,仿刺参EGFR基因氨基酸序列与果蝇EGFR相似性为49%,同源性为34%,与斑马鱼EGFR相似性为47%,同源性为34%,与淡水椎实螺EGFR相似性为49%,同源性为31%。据此推断,仿刺参EGFR基因属于EGFR家族成员。利用Real-time PCR技术检测了该基因在仿刺参各组织中的表达,结果显示在肠、呼吸树、表皮、体腔细胞、纵肌中EGFR均有表达,且体腔细胞和表皮表达量较高。结果表明,该基因可能在仿刺参组织发育和再生过程中起到重要的调控作用。     

北部湾3种金线鱼属鱼类CO I基因序列的比较分析

运用直接测序法对产自北部湾的日本金线鱼(Nemipterus,japonicus)、红棘金线鱼(N.nemurus)和苏门答腊金线鱼(N.mesoprion)3种金线鱼属鱼类的线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ(C0Ⅰ)基因序列进行了测序分析,并探讨了3种金线鱼之间的亲缘关系.在所分析的48条COⅠ同源序列片段(696 bp)中共检测到29个单倍型和104个核苷酸多态位点.单倍型分析结果显示,日本金线鱼和红棘金线鱼之间有明显的基因交流.序列差异分析和遗传距离比较结果显示,日本金线鱼与红棘金线鱼之间亲缘关系较近,无明显遗传分化.利用最大简约法(MP)和邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,日本金线鱼和红棘金线鱼混杂聚为一支,而苏门答腊金线鱼单独聚为一支.研究结果表明,日本金线鱼与红棘金线鱼的亲缘关系较近,二者可能为同种,而苏门答腊金线鱼则与日本金线鱼、红棘金线鱼亲缘关系较远.本研究为证实红棘金线鱼和苏门答腊金线鱼是2个不同的种提供了分子生物学的证据.     

两种大眼蟹线粒体12S rRNA基因序列的比较研究

测定了宽身大眼蟹和日本大眼蟹线粒体12S rRNA基因部分片段的序列,前者为577 bp, 后者为572 bp.二者的核苷酸序列A、T、G、C的含量相似,分别为39.0%、35.7%、16.5%、8.8%;39.3%、 36.2%、 15.8%、8.7%;不包括11处插入/缺失位点,两序列间有75个变异位点,核苷酸差异率为13.18%,其中转换42个、颠换33个, 转换与颠换比约为1.3.对国内外4种大眼蟹长度为331 bp的12S rRNA基因同源序列进行分析,A+T的平均含量为76.6%,明显高于G+C的平均含量,且存有变异位点52个,简约信息位点25个.系统发生树的拓扑结构显示,所有的大眼蟹聚为一支,支持大眼蟹类为一单系.     

普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参不同组织基因组DNA的MSAP研究

本研究分别以普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参基因组DNA为实验材料,应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术对刺参体壁、呼吸树和消化道3个组织的DNA甲基化水平和甲基化模式进行了研究,初步探讨了DNA甲基化对刺参组织间基因特异性表达的影响.结果显示,筛选得到的9对引物组合能够在普通刺参和白刺参两个群体中得到稳定扩增,在两群体刺参中分别检测到5932和5208个位点,均以未甲基化位点为主,普通刺参和白刺参未甲基化位点数分别为4317和3944,分别占总扩增条带数的72.78％和75.73％.普通刺参体壁的甲基化水平为31.07％,呼吸树为23.36％,消化道为26.34％;白刺参中体壁的甲基化水平为29.88％,呼吸树为23.25％,消化道为19.45％,由此可见,体壁的甲基化率在两群体中是最高的.普通刺参和白刺参同一组织间的甲基化水平和甲基化模式不同,同一群体体壁、呼吸树和消化道不同组织间的甲基化水平和模式也不同.甲基化在普通刺参和白刺参组织分化和发育过程中可能发挥着十分重要的作用.在检测的3个组织中,CCGG序列的全甲基化位点较半甲基化位点多.     

4种海参16SrRNA和COI基因片段序列比较及系统学研究

采用PCR技术对来自山东荣成、长岛、俄罗斯和日本的刺参(Apostichopus japonicus),来自澳大利亚的黄乳海参(Holothuria fuscogilva),来自冰岛的北大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)和来自福建的二色桌片参(Mensamaria interce-dens)的16SrRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度约为500bp和540bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数进行基因序列变异分析。结果表明,根据16SrRNA、COI基因片段进行刺参种内差异比较时,长岛和荣成刺参序列差异最小,和日本刺参序列差异最大;刺参和其他科3种海参种间的序列差异远远高于刺参种内差异。从GenBank中选取7条海参序列与本研究所测序列一同构建了NJ和ME系统树。根据2种基因片段的系统学分析均表明,刺参属和拟刺参属亲缘关系很近,可能有共同的起源。而海参科未与同属于楯手目(Aspidochirolida)的刺参科聚类,而与枝手目瓜参科和沙子鸡科聚为一支,与形态学的分类不一致。     

脊尾白虾热休克蛋白HSP90基因的原核表达与鉴定

将脊尾白虾热休克蛋白90基因克隆到原核表达载体pET-30a中,经酶切验证和DNA测序鉴定后,将重组质粒转化表达宿主大肠杆菌Rosetta,优化温度、时间、IPTG和OD600表达条件进行诱导表达,收集菌液,进行SDS-PAGE和质谱检测,并用Quantity one软件分析蛋白表达水平。结果表明,成功构建了含脊尾白虾HSP90基因的重组表达载体pET-30a-HSP90,表达目的蛋白相对分子量为82.7kD,为HSP90蛋白。通过条件优化认为重组菌株Rosetta/pET-30a-HSP90的最佳诱导温度为37℃,最佳IPTG浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时机和诱导时间分别为0.58h、7h。     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

2种大眼蟹线粒体COI基因序列的比较研究

测定了宽身大眼蟹(Macrophthalmus dilatatum)和日本大眼蟹(M.japonicus)线粒体细胞色素氧化酶I亚基(COI)基因片段的序列,其长度均为658bp,A、T、G、C的含量宽身大眼蟹为27.4%、30.9%、17.3%、24.4%,日本大眼蟹为25.8%、32.0%、17.4%、24.7%。宽身大眼蟹只有1种单倍型,日本大眼蟹出现2种单倍型,2种间有123(124)个变异位点,核苷酸差异率为18.69%(18.85%),其中转换68(69)处,颠换55(55)处,转换与颠换比约为1.2(1.3);种间差异远大于种内个体间差异(0.61%)。2种大眼蟹的AT(57.9%)含量明显高于GC含量,与其他蟹类COI基因研究结果相似。系统发生树的拓扑结构支持大眼蟹科与弓蟹科亲缘关系相对较近,二者为姊妹群关系。     

低盐胁迫对刺参 4 个盐度调节相关基因表达丰度的影响

从刺参(Apostichopus japonicus)低盐转录组数据库中选取与应激(热休克蛋白70基因)和离子传递(甘氨酸转运蛋白基因、锌转运蛋白基因、神经乙酰胆碱受体基因)相关的4个差异表达基因,利用qRT-PCR技术分析这4个基因在不同组织中的表达水平及低盐对其表达丰度的影响.结果表明甘氨酸转运蛋白基因在刺参呼吸树中表达水平最高,肠次之,体腔液表达较低;锌指蛋白基因和神经乙酰胆碱受体基因均在体腔液中表达最高,肠次之,在呼吸树中不表达;热休克蛋白70基因在体腔液中表达量最高,其次是呼吸树和肠组织.低盐胁迫下这4种基因的表达量均随着胁迫时间的延长呈波动性增减,其中甘氨酸转运蛋白在体腔液中的表达低于正常表达水平,在胁迫后3h时达到最低表达量.神经乙酰胆碱受体基因除在体腔液中48 h出现明显的上调外,在体腔液其他时间点和肠组织中处于下调表达状态.低盐胁迫下这4个基因表达丰度的变化,说明这些基因或作为功能蛋白直接参与机体的代谢调节,或作为调控蛋白调节胁迫功能蛋白的表达和活性来提高刺参对低盐胁迫的耐受能力.研究结果可为刺参盐度调节适应机制的研究奠定基础.