犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株非结构蛋白基因的克隆及测序

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了9对引物,采用RT-PCR方法对PRRSV GS株的非结构蛋白基因ORF1进行了分子克隆,并对其核苷酸序列及编码氨基酸进行了分析。结果表明:ORF1全长11 882 bp,其中ORF1a核苷酸长7 512bp,编码2 503个氨基酸,ORF1b核苷酸长4 374 bp,编码1 457个氨基酸。PRRSV GS株ORF1基因与VR-2332株ORF1基因核苷酸同源性较高,其中ORF1a为89.3%,ORF1b为90.7%,而与LV株同源性相比较低,其同源性分别为54.3%和60.8%,相对ORF1a来说,ORF1b较为保守。ORF1编码的产物为2个聚合蛋白,ORF1a所编码的聚合蛋白经水解酶切割后产生6个成熟的非结构蛋白(NSP),其中NSP2变异最大,该蛋白具有耐受碱基插入、突变的能力,可能与PRRSV对组织细胞的亲嗜性有关;ORF1b编码的聚合蛋白经蛋白酶切割后,产生4个成熟的非结构蛋白。从系统发生树分析,PRRSV GS株非结构蛋白基因区域在基因型上属于北美洲型。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因 (ORF1)和非编码区分别进行了克隆和测序 ,并对其基因特征作了分析。结果表明 ,CH_1a株ORF1全长 11882nt,其中ORF1a长 75 12nt、ORF1b长 4374nt。它们与VR2 332株的核苷酸同源性分别为 89%、92 % ;与LV株的核苷酸同源性分别为 5 4%、6 3.3%。ORF1编码两个聚合蛋白 ,其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生 6个成熟的非结构蛋白 (Nsp1α、Nsp1β、Nsp2_5 ) ,以Nsp2的变异性最为显著 ,它与LV株的氨基酸同源性为 41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后 ,产生 4个成熟的非结构蛋白 (RdRpCP2_4) ,其中RdRp为病毒的复制酶 ,CP4表现出较大的变异性 ,与LV株的氨基酸同源性为 48%。在ORF1a_ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构 ,它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区 ,其中 5’NCR长 190nt,比LV株 5’NCR短 31nt,其核苷酸同源性为 6 1%。 3’NCR长 15 1nt,比LV株 3’NCR长 37nt,保守性稍高 ,其与VR2 332株和LV株的核苷酸同源性分别为 95 .4%和 78.2 %。在 3’NCR末端有一个poly(A)尾巴 ,长 2 0nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列 ,是复制酶识别并结合的区域。本研究进一步证实CH_1a株在基因型上属于北美洲型     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-la株非结构基因的分子克隆及其基因特征的研究

对猪繁殖与呼吸综合征病毒的非结构基因（ORF1）和非编码区分别进行了克隆和测序，并对其基因特征作了分析。结果表明，CH-1a株ORF1全长11882nt，其中ORF1a长7512nt、ORF1b长4374nt。它们与VR2332株的核苷酸同源性分别为89%、92%；与LV株的核苷酸同源性分别为54%、63.3%。ORF1编码两个聚合蛋白，其中ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生6个成熟的非结构蛋白（Nsp1α、Nsp1β、Nsp2-5)，以Nsp2的变异性最为显著，它与LV株的氨基酸同源性为41%。ORF1b编码的聚合蛋白经裂解后，产生4个成熟的非结构蛋白（RdRp,CP2-4)，其中RdRp为病毒的复制酶，CP4表现出较大的变异性，与LV株的氨基酸同源性为48%。在ORF1a-ORF1b的衔接区有保守的庚核苷酸滑动序列和拟节结构，它们是核糖体移码翻译所必需的结构。在基因组末端存在非编码区，其中5'NCR长190nt，比LV株5'NCR短31nt，其核苷酸同源性为61%。3'NCR长151nt，比LV株3'NCR长37nt，保守性稍高，其与VR2332株和LV株的核苷酸同源性分别为95.4%和78.2%。在3'NCR末端有一个poly(A)尾巴，长20nt。在Poly(A)尾上游有保守的八核苷酸序列，是复制酶识别并结合的区域。本研究进一步证实CH-1a株在基因型上属于北美洲型。     

新城疫病毒广西分离株M基因的克隆与序列分析

根据基因库中新城疫病毒M基因核苷酸序列,设计一对特异性引物,对2000年-2003年期间广西分离的11个NDV毒株的M基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定.结果表明,11个NDV广西分离株的M基因都为1 223个核苷酸,含有1个1 095 bp核苷酸阅读框(ORF),编码364个氨基酸.序列分析结果表明,这11个NDV分离株核苷酸的同源性在86%～99.9%之间,推导氨基酸的同源性在89.3%～99.7%之间;11个毒株与国内外其他7个NDV毒株比较核苷酸的同源性在83.3%～98.5%之间,推导氨基酸的同源性在87.4%～98.6%之间.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因变异分析

采用RT-PCR方法对不同省份疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序,获得14个ORF5基因片段.序列分析结果表明,获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%.与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%、86.6%～88.6%、85.6%～87.6%、54.7%～56.2%之间.表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型.进一步分析发现与近期国内流行的高致病性猪蓝耳病病毒同源性非常之高,说明这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪的运输流通等在全国流行.     

马动脉炎病毒大囊膜蛋白和膜蛋白基因的克隆与序列分析

参考GenBank收录的马动脉炎病毒(EAV)读码框大囊膜蛋白基因oRF5、膜蛋白基因ORF6的核苷酸序列，分别设计了2对引物，对EAV的这两种主要结构蛋白基因进行了RT—PCR；将扩增产物克隆于pUC18通用载体，对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实克隆片段的可靠和准确性。测序结果，ORF5目的片段包含768bp，编码255个氨基酸组成的多肽；ORF6目的片段包含489bp，编码162个氨基酸组成的多肽。与EAVNC-002532标准毒株比较，ORF5、ORF6核苷酸的同源性分别为99．1％和99．4％；推导氨基酸的同源性分剐为96．99／6和98．29／6。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR方法对2006-2007年华南地区部分省份的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得13个Nsp2基因的部分序列片段和14个ORF5基因片段。序列分析结果表明,所获得的13个Nsp2基因序列中均有2个区域存在明显缺失,核苷酸的同源性为96.9%～99.1%,与中国代表毒株CH-1a、美洲株代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别为85.1%～86.4%和67.2%～68.9%,与疫苗株MLV的同源性在67.6%～68.9%之间,而与欧洲株代表株LV的同源性在54.1%～55.9%之间;获得的14个ORF5基因序列不存在缺失现象,核苷酸的相似性为同源性为98.8%～99.7%,推导编码氨基酸同源性为96.5%～99%。与国内毒株相比,核苷酸同源性为85.2%～100%,氨基酸同源性为84.6%～99%;与中国代表毒株CH-1a、美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性分别在94.4%～95.2%和86.7%～87.9%之间,与疫苗株MLV的同源性在86.4%～87.6%之间,而与欧洲型代表株LV的同源性在54.1%～55.7%之间,推导编码的氨基酸序列同源性则分别在91.5%～93.5%,86.6%～88.6%,85.6%～87.6%,54.7%～56.2%之间。结果表明所获得序列的流行毒株均属于美洲型,进一步分析发现这些毒株可能均起源于同一个毒株,通过猪运输流通等途径在全国范围流行扩散。     

6株鸽源新城疫病毒广西分离株F基因的遗传演化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的6株鸽源新城疫病毒F基因进行扩增、序列测定和分析。结果显示:只有1株分离株F基因的ORF全长为1 659 bp,编码552个氨基酸,其他5株分离株F基因的ORF全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,6株分离株的F0蛋白裂解位点的序列均为112RRQKRF117,符合强毒株的序列结构特性;核苷酸同源性比较显示,6株分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为91.3%~99.3%(与比利时分离株11(JX901124)的同源性最高),与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%~89.2%。与经典强毒株F48E9相比,核苷酸序列同源性为83.6%~84.8%,氨基酸序列同源性为89.2%~92.4%;与Ⅰ型疫苗株V4、I-2相比,核苷酸同源性分别为83.6%~85.1%和82.6%~84.2%,氨基酸序列同源性分别为88.1%~91.3%和87.7%~90.8%;与Ⅱ型疫苗株La Sota和B1相比,核苷酸同源性分别为81.7%~83.9%和82.0%~83.9%,氨基酸序列同源性分别为86.6%~89.9%和86.6%~89.9%。遗传进化分析显示,6株广西鸽源分离株与2011年比利时分离株11(JX901124)和中国毒株SDS、LLN713、BJP13、LJL404、P4的遗传关系最为接近,位于同一进化树分支上,属于基因Ⅵb亚型。     

猪细环病毒1b型ORF3基因克隆及序列分析

为明确福建省猪细环病毒（porcine torque teno sus virus,PTTSuV）1b型（PTTSuV-1b）ORF3基因的遗传进化特征,本研究根据GenBank中登录的PTTSuV-1b基因组特征设计特异性引物,对福建省某猪场患有仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的猪血清进行PTTSuV-1b分段扩增,并分别对PCR扩增产物进行胶回收后克隆测序,将测序结果经BLAST分析后进行序列拼接。试验结果表明,所扩增的目的片段编码有完整的PTTSuV-1b ORF3蛋白,全长为600 bp,编码有199个氨基酸。将获得的PTTSuV-1b型福建株与GenBank中PTTSuV-1b型的ORF3基因进行比对分析,其与FJ/China/2010/TTV2/2株核苷酸同源性最高,为99.7%,与西班牙PTTSuV-1b分离株TTV2_G43核苷酸同源性为97.3%,与SC株核苷酸同源性稍低,但也达94.0%;而与猪细环病毒K2型德国家猪分离株472142株核苷酸同源性仅为60.7%,与猪细环病毒1a型西班牙分离株PTTV1_1914株核苷酸同源性仅为46.8%。从遗传进化关系上看,PTTSuV-1b ORF3基因在遗传进化上呈2个大的遗传进化分支（分支Ⅰ和分支Ⅱ）,本研究分离株处于分支Ⅰ。     

PRV LA株gD基因的序列测定及其重复高变区的发现

对猪伪狂犬病病毒鲁A株(PRVLA株)gD基因进行了克隆和序列测定，结果表明：在测序的l453bp的DNA序列中包括着1个l203bp的ORF(即gD基因)，它编码400个氨基酸组成的多肽；在整个gD基因的ORF内PRVLA株与PRV Ea株、Hulbei株、Rice株、NIA-3株、Kaplan株的gD基因比较，核苷酸的同源性分别为98．3％、98．3％、98．0％、98．1％、98．6％，氨基酸的同源性分别为97．8％、97．8％、97．5％、98．1％、98．6％；发现PRVLA株gD基因与Ea株、Hubei株、Rice株、NIA-3株、Kaplan株的gD基因均在802～837nt处有1个C(A)GGCCC的重复高变区，其对应的是gD267～279位氨基酸残基Arg—Pro的重复高变区。正是该重复高变区的碱基缺失或插入使得PRVgD的ORF在l194～l215nt间变化，gD前体的氨基酸残基为398～404个。     

Cloning and Sequence Analysis of Complete Genomes of Porcine Circovirus Type 2 (PCV-2) Jiangxi Strains

In order to understand the epidemiology and evolution of PCV-2 in Jiangxi province, a pair of primers was designed according to the PCV-2 gene sequence published in GenBank. After PCR amplification, we got the whole genome sequence of 9 strains PCV-2 isolates, and the nucleotide and protein sequences were analyzed, the genetic evolutionary tree was constructed. The results showed that the complete genome of 8 out of the 9 strains were 1 767 bp in length and one strain was 1 768 bp. By analyzing the whole genome sequences of the nucleotide,the homology of nucleotide sequences of the 9 strains was 94.7% to 99.9%.Compared with other whole genome sequences of PCV-2 in GenBank, the homology was 94.3% to 99.8%. The homology of nucleotide sequences of the ORF1 of the 9 strain was 96.9% to 100.0%. ORF2 and ORF3 encoding protein amino acid sequence had some locus mutation. Phylogenetic tree analysis showed that the 9 strains could be divided into 3 genotypes,5 strains belonged to PCV-2b, 3 strains belonged to PCV-2d, and 1 strain belonged to PCV-2a. This study was helpful to monitor and control of PCV-2 in Jiangxi province.     

猪圆环病毒2型江西株的全基因组克隆和序列分析

为了解江西地区猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行和进化情况,根据GenBank上已发表的PCV-2全基因序列设计1对引物,PCR扩增后得到9条PCV-2全基因序列,并对其全基因序列核苷酸和蛋白序列进行分析,绘制遗传进化树。结果表明,江西地区流行的9株PCV-2中,基因组序列全长分为8株1 767 bp和1株1 768 bp,9株PCV-2的核苷酸同源性为94.7%~99.9%,与GenBank己发表的PCV-2分离株全基因组同源性介于94.3%~99.8%之间,而9株PCV-2的ORF1核苷酸序列同源性为96.9%~100.0%。ORF2和ORF3编码的蛋白氨基酸序列存在部分位点突变。遗传进化树显示为3种基因型：5株PCV-2b、3株PCV-2d、1株PCV-2a。本研究有助于江西地区PCV-2的监测和防制。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gI） 基因核苷酸序列测定及分析

对我国最早分离的伪犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)Fa株糖蛋白gp63(gI)基因核苷酸序列及的氨基酸序列作了测定与分析，完整的gp63(gI)结构基因从起始密码子ATG到终止密码子TGA共有1050个核苷酸残基，编码由439个氨基酸残基构成的多肽链，4种核苷酸残基的构成比分别为：G35．9％，11.33%,T11.81%,C40.95%,G C含量达76．85％，PRV Fa株gp63基因核苷酸序列与Nice株的相比，两者同源性达98．13％，仅存在3个核苷酸残基的缺失变异，氨基酸推导序列分析表明，糖蛋白gp63具有典型膜蛋白特征，与Nice株相比，同源性为97．42％，gp63基因起始密码子由3个连续的ATG组成，ATG上游区域内无启动子调控区序列。     

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的克隆及序列分析

本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,利用PCR方法从已鉴定为2型鸭疫里默氏菌RA-FJ株的基因组DNA中扩增目的基因片段,胶回收PCR扩增片段,克隆到pMD18-T载体后进行序列测定.采用生物信息学软件对测序结果进行分析,结果表明所获得的RaDtxR基因编码完整的开放阅读框,全基因长度为654 bp,编码217个氨基酸.所编码的蛋白大小为24.82 ku,理论等电点为5.69,不稳定系数为38.45,属于稳定蛋白质类.将其与GenBank中已发表的RaDtxR基因序列进行核苷酸同源性比对分析,结果显示其与鸭疫里默氏菌疫苗株RA-CH-1株(GenBank登录号:CP003787)的核苷酸同源性为100.0%,与其他4株核苷酸同源性均为99.8%,仅在186位处存在无义突变.利用该基因对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的鸭大肠杆菌、禽多杀性巴氏杆菌和沙门氏菌进行扩增,结果显示均未扩增到条带,对福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定的1型、2型、3型、11型和13型鸭疫里默氏菌均可扩增出特异性目的条带,表明RaDtxR基因可作为鸭疫里默氏菌鉴别诊断的靶基因.试验结果表明,本研究成功克隆到鸭疫里默氏菌RaDtxR基因,为研究其功能奠定基础.     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析

采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

猪圆环病毒2型天津及周边地区分离株的遗传演化分析

为了解天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2,PCV2）的流行毒株遗传变异情况,本研究应用基因克隆技术和生物信息学分析软件对24株PCV2分离株全基因及ORF2基因分别进行克隆、测序、同源性比对和遗传进化分析。全基因组序列分析结果显示,24株PCV2分离株全基因组序列有14株为1 767 bp,10株为1 768 bp。用DNAStar软件对全基因组序列同源性比对表明,24株PCV2分离株与NCBI上的PCV2参考株的全基因序列同源性为93.6%~99.8%,24株分离株之间的全基因组序列差异很小,同源性为94.0%~99.9%。同时,用DNAStar对PCV2分离株的ORF2基因序列同源性分析表明,其与NCBI上的PCV2 ORF2基因参考序列的核苷酸序列同源性为87.3%~99.3%,24株分离株ORF2基因核苷酸序列同源性为89.0%~100.0%,3株分离株（10084F4、R14040及R14086）的核苷酸序列同源性为100.0%。对全基因和ORF2基因的遗传进化分析表明,24株分离株的系统进化树被分为2个大分支,其中23株分离毒株属于PCV2b亚型,1株属于PCV2a亚型,未分离出PCV2c亚型。综上所述,天津及周边地区PCV2的流行模式仍以PCV 2b亚型为主,本研究为该地区PCV2的流行变异情况研究提供了一定的理论依据。