景宁木兰热胁迫下实时荧光定量PCR内参基因的筛选

高温对景宁木兰Magnolia sinostellata生长产生严重影响。通过筛选景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因,可以为景宁木兰在高温条件下基因表达研究提供准确数据,达到对目的基因进行准确量化的目的。以热胁迫下景宁木兰1年生实生苗的根、茎、叶组织为材料,从转录组数据库中选取13个管家基因ACTIN-7（肌动蛋白基因-7）,CYP（亲环蛋白基因）,EF-1α（延伸因子-1α蛋白基因）,GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）,GTB（GTP结合蛋白基因）,NAC（NAC域蛋白基因）,NADP（异柠檬酸脱氢酶基因）,TEF（翻译延伸因子基因）,UBC（泛素化酶基因）,UBQ（多聚泛素蛋白基因）,α-TUB（α微管蛋白基因）,β-TUB（β微管蛋白基因）和18S（18S核糖体RNA）,通过Primer 5.0进行引物设计,琼脂糖电泳和溶解曲线分析验证引物特异性;利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术和geNorm,NormFinder和BestKeeper等3个内参分析软件研究候选内参基因在热胁迫下不同组织中的表达稳定性,并通过CSLD3和KOR 2个目的基因的表达分析验证其可靠性。13个内参基因的电泳结果均显示单一条带,溶解曲线也均显示单一峰,证明引物特异性良好;13对引物的扩增效率均在100%左右;内参软件综合分析得到,UBC,EF-1α和ACTIN-7是景宁木兰在热胁迫下较为稳定的内参基因,以3个单独的内参基因以及内参组合（EF-1α和ACTIN-7）为参照对CSLD3和KOR的表达模式进行校准,也显示了一致的表达水平。通过qRT-PCR技术和内参软件分析,UBC,EF-1α和ACTIN-7等3个内参基因在景宁木兰热胁迫下不同组织中稳定性较高,CSLD3和KOR等2个目的基因的表达也证实了其可靠性。因此,UBC,EF-1α和ACTIN-7可以作为景宁木兰热胁迫下稳定表达的内参基因。     

景宁木兰PIF转录因子的生物信息学分析及极端遮阴条件下的表达模式

  目的  群落所造成的遮阴是导致景宁木兰Magnolia sinostellata濒危的重要因素之一。PIF家族转录因子在光信号传导和植物生长发育中起到重要作用。对PIF家族转录因子进行系统分析和研究,为探究其在景宁木兰光信号转导机制中的作用奠定基础。  方法  从景宁木兰转录组数据中鉴定获得PIF家族转录因子并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术对其在极端遮阴条件下的表达模式进行分析。  结果  从景宁木兰转录组中共筛选出9个MsPIFs转录因子基因,其编码的蛋白质长度为188~735 个氨基酸,蛋白质大小为20 314.56~78 957.02 Da,理论等电点范围为5.18~8.22。MsPIFs基因编码的蛋白质均为不稳定蛋白质,所有蛋白质均为亲水性蛋白质。亚细胞定位预测结果显示所有蛋白质均定位于细胞核。9个蛋白质均具有丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Try)磷酸化位点。qRT-PCR结果表明:极端遮阴条件下,9个MsPIFs家族基因表达均发生不同程度的变化。其中,MsbHLH23的表达变化较其他基因更为明显,遮阴处理5和10 d时的表达量分别上调为对照的52.77与20.03倍。  结论  景宁木兰PIF转录因子家族均能响应遮阴,为后续对MsPIFs进行生物学功能鉴定奠定了基础。图7表3参32     

硒对高温胁迫下生菜碳代谢的影响

[目的]硒(Se)是植物生长的有益营养元素,为探明硒缓解生菜高温胁迫的生理生化机制.[方法]以'北散生3号'为试验材料,采用水培,研究硒对高温胁迫下生菜生长、可溶性糖、蔗糖、果糖、葡萄糖和淀粉含量以及蔗糖代谢关键酶的影响.[结果]高温胁迫下,生菜幼苗的叶宽、叶鲜质量、根干鲜质量均显著下降,叶长增加;果糖和蔗糖含量降低,可溶性糖和葡萄糖含量显著增加;蔗糖合成酶(SS)的活性先升高后降低,蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性显著下降,酸性转化酶(AI)活性显著升高.高温胁迫下喷施亚硒酸钠后,显著提高了生菜幼苗的叶鲜质量和根干鲜质量,降低了叶长,降低了葡萄糖、淀粉和可溶性总糖含量,显著增加了SS和SPS酶活性,降低了AI酶活性.[结论]喷施亚硒酸钠能够通过提高生菜幼苗糖代谢能力,从而缓解高温伤害.     

不同光照强度下濒危植物景宁木兰幼苗光合特性的季节变化

  目的  探讨濒危植物景宁木兰Magnolia sinostellata在不同光照强度下光合能力的季节变化及适应机制,为种群的繁衍复壮和迁地保护等提供理论依据。  方法  以2年生景宁木兰幼苗为对象,在3种光照处理下(100%全光照、40%全光照和10%全光照),对春季、夏季、秋季3个季节的光合特性指标进行了测定与分析。  结果  ①春季100%全光照和夏季100%全光照、40%全光照下净光合速率日变化均呈“双峰”曲线。②夏季100%全光照、40%全光照下最大净光合速率、光饱和点、光补偿点均显著高于10%全光照(P＜0.05),而秋季100%全光照下最大净光合速率、光饱和点却显著低于40%全光照和10%全光照(P＜0.05)。③夏季、秋季100%全光照下最大电子传递速率和磷酸丙糖利用率均显著低于40%全光照(P＜0.05)。④100%全光照下光系统Ⅱ(PS Ⅱ)最大光化学量子产量在夏季、秋季分别为0.68和0.72。100%全光照下光化学猝灭系数和40%全光照下PSⅡ实际光化学量子产量在夏季均显著高于春季、秋季(P＜0.05)。  结论  在100%全光照下,景宁木兰易受夏季高温和强光胁迫,致使叶片灼伤,秋季净光合速率明显下降,而适当遮光条件下,景宁木兰在3个季节均能维持较高的净光合速率。因此,在景宁木兰栽培过程中,建议光合有效辐射保持在自然光照强度的40%以上。图5表1参23     

高温胁迫下萝卜苗期的转录组分析

【目的】对高温胁迫下萝卜幼苗进行转录组测序分析,筛选不同耐热性萝卜品种间的差异表达基因,为阐明萝卜幼苗响应高温胁迫的分子机制提供理论参考。【方法】以耐热萝卜品种1116T和热敏感萝卜品种Wr129为对象,对其进行高温（40℃）胁迫处理0（常温,对照）和24 h,提取各时间点样品总RNA进行转录组测序,以|log₂ FoldChange|≥1,P<0.05且TPM≥10为标准,筛选出差异表达基因（DEGs）,并进行GO功能注释和KEGG代谢通路富集分析。【结果】随着高温胁迫时间的增加,Wr129和1116T幼苗茎叶逐渐发生萎蔫,胁迫24 h后Wr129叶片萎蔫下垂且干枯变黄,而1116T叶片轻度萎蔫下垂,仍保持绿色。12个文库共获得81.45 Gb Clean data,平均有62.30%的reads比对到萝卜参考基因组的一个位置。从2个不同耐热性品种中共鉴定到2701个差异表达基因。GO功能注释结果显示,2629个差异表达基因在GO数据库中得到注释,其中,有559个差异表达基因被注释为细胞组分类别中的叶绿体被膜、叶绿体基质和叶绿体类囊体3个条目,470个差异表达基因被注释为与胁迫响应相关的生物学过程。KEGG代谢通路富集结果显示,1166个差异表达基因富集到124条代谢通路,其中,有74个差异表达基因富集到光合作用和光合作用-天线蛋白代谢通路,23个基因富集到卟啉和叶绿素代谢通路,大部分基因在高温胁迫下被诱导; 35个差异表达基因富集到谷胱甘肽代谢途径,其中14个谷胱甘肽-S-转移酶基因（GSTs）在高温胁迫下上调表达。高温胁迫24 h,Wr129和1116T幼苗叶片PSII的最大光化学效率（F_v/F_m）和总叶绿素含量均下降,但1116T的下降幅度较小。【结论】 Wr129和1116T的耐热性存在明显差异,其原因是1116T植株可通过调控光合作用和抗氧化系统相关基因的表达,减缓F_v/F_m和叶绿素含量下降速率,从而提高植株对高温胁迫的耐受能力。     

蜡梅花转录组数据分析及次生代谢产物合成途径研究

蜡梅是特产于我国的具有优良观赏性状的传统花卉,除了用于园林绿化外,还具有重要的药用价值。蜡梅的分子生物学研究开展较晚,基因数据库资源极少。本文采用Illumina GAIIx高通量测序——转录组测序(RNA-seq)技术对蜡梅花进行转录组测序,获得了超过3.8Gb的数据。将获得的Unigene与4个基因数据库进行比较,并对Unigene进行功能预测。结果表明,蜡梅花转录组数据库中的Unigene可归纳到43个GO聚类中,其中有大量的基因与代谢过程、催化反应、结合过程和细胞进程相关。代谢途径的分析有助于对基因生理功能的预测,库中31142个Unigene可定位到266个不同的代谢分支中。对蜡梅花转录组的组装和功能注释获得了大量转录本信息,为蜡梅的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据来源。基于蜡梅花的生理特性,初步探索利用蜡梅花转录组数据库研究次生代谢产物,分析转录组数据库中与花香、花色、生物碱合成途径相关的基因,发掘蜡梅研究开发应用新领域。     

植物次生代谢合成途径及生物学意义

简述了植物次生代谢产物的类型、合成途径及其代谢调节,重点阐述了次生代谢产物在最近几年的的学科发展,论述了植物的次生代谢途径与其生物学功能之间的关系,从而加深了人们对次生代谢产物的认识,对其开发利用提供理论依据.     

不同基因型香料烟叶片发育过程中碳氮代谢关键酶活性及代谢产物变化

研究了浙江新昌不同基因型香料烟叶片发育过程中碳氮代谢关键酶的活性及代谢产物的含量变化规律.结果表明,在香料烟叶片发育过程中,酸性转化酶(INV)的活性均呈下降趋势;谷氨酰胺合成酶(GS)的活性Samsun品种在20天叶龄时最高,而Basma和Canik在30天叶龄时最高;苯丙氨酸解氨酶(PAJL)的活性均表现为30天时最低;随着叶片成熟总氮含量降低,烟碱含量升高,总碳、可溶性总糖随着叶片成熟其含量呈升高趋势;品种不同,碳氮代谢关键酶的活性及代谢产物的含量变化均有很大差异.     

高温胁迫对辣椒果实活性氧代谢的影响

以辣椒品种“驻椒22”为试材,研究辣椒果实相应高温胁迫活性氧代谢的影响,为预防辣椒果实灼伤及果实优质生产提供依据。研究结果表明：高温胁迫使辣椒果实中O_{2·生产速率、H2O2含量、MDA含量升高,明显增强了辣椒果实中的POD、SOD、APX、CAT的活性,提高了PRO和可溶性蛋白含量。在高温胁迫下,辣椒果实中出现了维持活性氧代谢的清除能力,减缓了高温对细胞膜的伤害。}     

红花玉兰大小孢子发生及雌雄配子体发育的研究

【目的】对红花玉兰(Magnolia wufengensis)大、小孢子发生及雌、雄配子体发育过程进行显微观察,探讨其自然状态下结籽率低的原因。【方法】于2012年5月红花玉兰花芽分化开始每月采花芽1次,直至次年开花,采用常规石蜡切片法制片,对红花玉兰大、小孢子发生及雌、雄配子体发育进行详细的细胞学观察。【结果】红花玉兰雌蕊成熟时倒生胚珠,双珠被,厚珠心,大孢子为单胞子发生型,成熟胚囊为7胞8核胚囊,蓼型胚囊发育方式。雄蕊花药四室,腺质型绒毡层,成熟花粉粒为二细胞型。【结论】红花玉兰大、小孢子发生以及雌、雄配子体发育过程中未见异常现象,因此该物种雌、雄蕊发育不是导致其濒危的因素。     

缢蛏在急性温度胁迫下的氧化应激响应及生理代谢变化

探究急性温度胁迫下缢蛏(Sinonovacula constricta)的氧化应激响应及生理代谢变化,评价缢蛏适应气候变化的能力。本实验将暂养净化后的缢蛏分为7组,分别在4℃、10℃、15℃、20℃（对照）、25℃、30℃、35℃的水浴下温度胁迫6h后,缓慢回复至对照组温度（20℃）,检测各组缢蛏鳃及消化腺组织中SOD活性、POD活性、CAT活性、T-AOC能力和MDA含量、GSH含量、H2O2含量。结果表明：各指标在6h,4℃、10℃、30℃、35℃的胁迫后均变化显著（P<0.05）;相较低温胁迫,在高温胁迫下的SOD、POD、MDA、GSH等指标都有更显著的变化（P<0.05）;在24h温度回复后,4℃低温组和35℃高温组的各指标均不能恢复到对照组水平。研究表明,低温和高温胁迫均会引起缢蛏鳃和消化腺中抗氧化系统的失衡,导致活性氧的显著变化;SOD、CAT、POD和GSH在机体应对温度胁迫导致的氧化损伤中起到不同的作用;在极端环境温度变化超过缢蛏的耐受极限,达到致死温度时,机体的抗氧化调节系统失衡,会造成不可修复的氧化损伤,影响其正常的生理活动。     

梅花2个PmWRKY2基因克隆及在逆境胁迫下的表达模式

  目的  低温是影响梅花Prunus mume栽培应用的重要环境因素。WRKY基因是一类主要存在于植物中的转录因子,参与响应非生物胁迫等过程。了解梅花WRKY基因对非生物和脱落酸(ABA)胁迫的响应,对梅花定向育种具有重要的意义。  方法  以梅花‘骨红朱砂’Prunus mume ‘Guhong Zhusha’为材料,通过反转录PCR(RT-PCR)克隆获得了2个WRKY2转录因子,命名为PmWRKY2-1和PmWRKY2-2;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析PmWRKY2-1和PmWRKY2-2基因在低温和干旱下的表达模式。  结果  PmWRKY2-1和PmWRKY2-2的编码区长度分别为2 223和2 220 bp,分别编码740和739个氨基酸,包含2个WRKY结构域和C₂H₂型锌指结构;PmWRKY2-1与PmWRKY2-2亲缘关系较远,但两者与蔷薇科Rosaceae植物欧洲甜樱桃P. avium、桃P. persica、李P. dulcis的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:在低温和干旱处理下,PmWRKY2-1与PmWRKY2-2都能被诱导;脱落酸(ABA)处理后,PmWRKY2-1与PmWRKY2-2的表达显著降低。  结论  PmWRKY2-1与PmWRKY2-2可能参与调控梅花低温和干旱响应,并可能受到ABA的调控。图6表1参28     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

澳洲坚果MiSTPP6基因克隆及低温胁迫下表达分析

【目的】克隆澳洲坚果丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1）家族基因（MiSTPP6）,并分析其不同组织及低温胁迫下的表达模式,为澳洲坚果PP1家族基因的抗寒分子机制提供理论依据。【方法】基于澳洲坚果转录组测序结果,利用RT-PCR技术克隆MiSTPP6基因,对其序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR检测其在不同组织及低温胁迫下的表达情况。【结果】从澳洲坚果中克隆获得MiSTPP6基因（GenBank登录号为MT374553）,其cDNA全长2129bp,最大的阅读框（ORF）长度为948bp,编码315个氨基酸残基,含有PP1蛋白家族的典型结构域（MPP_PP1_PPKL）和特征性序列（LRGNHE）。MiSTPP6蛋白为稳定的亲水性蛋白,以丝氨酸磷酸化为主,可能定位于细胞质,属于非分泌型蛋白或膜蛋白,与已知植物PP1蛋白的氨基酸序列具有很高的相似性。MiSTPP6蛋白的二级结构由α-螺旋(占40.00%)、无规则卷曲(占32.38%)、延伸链（占18.41%）和β-转角（占9.21%）,其三级结构与模板蛋白4v0u.1.A的结构相似度为80.60%,GMQE值为0.89。MiSTPP6基因在根、茎、叶、刚开放的小花和谢花后30~45d的小果中均有表达,其中,MiSTPP6基因在刚开放的小花中的相对表达量最高。4 ℃低温胁迫后0.5~24.0h,MiSTPP6基因在澳洲坚果苗期叶片中的相对表达量较对照明显下调,整体上呈持续下降的趋势。【结论】MiSTPP6属于PP1家族基因,具有组织表达特异性,可能在澳洲坚果抗寒分子机制中发挥重要的调控作用。     

Cd胁迫下外源谷胱甘肽对紫花苜蓿氮代谢及Cd累积特征的影响

为研究镉（Cd）胁迫下外源谷胱甘肽（GSH）对紫花苜蓿（Medicago sativa）氮代谢及Cd累积特征的影响,以4种紫花苜蓿为植物材料,设置对照、Cd处理和混合处理（Cd+GSH）开展水培试验。结果表明,Cd胁迫影响紫花苜蓿氮代谢,谷氨酸合成酶活性较对照处理最高降低43.79%。Cd胁迫下喷施GSH后,总氮、氮代谢关键酶活性、游离氨基酸和可溶性蛋白较Cd处理均有不同程度地变化,其中谷氨酸合成酶活性较Cd处理最高增加79.05%。外源GSH影响紫花苜蓿体内Cd的化学形态与亚细胞分布：施加GSH后盐酸提取态占比较Cd处理最高增加14.81个百分点;外源GSH处理下液泡中的Cd含量占比较Cd处理最高上升11.91个百分点;GSH处理还能显著提高紫花苜蓿植物螯合肽（PCs）含量,有效阻止Cd以游离态的形式进入细胞器。研究表明,Cd胁迫下外源GSH可提高紫花苜蓿硝酸还原酶等氮代谢关键酶活性,维持氮代谢正常进行;外源GSH可能通过提高PCs的合成水平和减轻Cd毒害,间接对氮代谢进行调控。     

蒜芥茄SsWRKY1基因克隆及黄萎病病原菌胁迫下表达分析

【目的】克隆蒜芥茄WRKY1基因(SsWRKY1),并分析其在黄萎病病原菌胁迫下的表达模式,为探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黄萎病抗性中的调控机制提供理论参考。【方法】利用染色体步移技术克隆SsWRKY1基因,通过在线生物信息学软件进行序列分析及构建系统发育进化树;采用GFP融合蛋白表达法对WRKY1蛋白进行亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SsWRKY1基因在不同组织及接种黄萎病病原菌后不同时间的相对表达量。并分析9种野生茄材料接种黄萎病病原菌后的病情指数与WRKY1基因表达变化量的相关性。【结果】克隆获得的SsWRKY1基因(GenBank登录号MZ846202)ORF序列长度为1224 bp,编码407个氨基酸残基,蛋白相对分子量为44.87 kD,理论等电点(p I)为6.91,属于亲水性不稳定蛋白,亚细胞定位于细胞核,符合转录因子特征。SsWRKY1蛋白含有2个WRKY保守结构域和C2H2型锌指结构,属于Ⅰ类WRKY转录因子,其二级结构主要由α-螺旋(7.13%)、β-折叠(4.67%)、无规则卷曲(73.71%)和延伸链(14.50%)组成。SsWRKY1蛋白与番茄、野生潘那利番茄、野生番茄、马铃薯WRKY1蛋白的亲缘关系较近。SsWRKY1基因在根和茎的相对表达量显著高于叶中的相对表达量(P<0.05,下同)。黄萎病病原菌接种后不同时间,SsWRKY1基因的相对表达量均低于对照组(无菌水接种),但仅在24 h时二者差异达显著水平。9种野生茄材料接种黄萎病病原菌后的病情指数与接种前后WRKY1基因表达变化量间呈显著正相关。【结论】SsWRKY1属于第Ⅰ类WRKY转录因子,序列高度保守,在细胞核中表达,其基因具有组织表达特异性,黄萎病菌胁迫后该基因的表达下调,推测WRKY1在野生茄黄萎病抗性中起负调控作用。