猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的效价测定及保存稳定性研究

为评估市售商品化猪乙型脑炎(JE)弱毒活疫苗的质量以及实验室条件下疫苗的保存稳定性,采用TCID50效价测定和RT-PCR检测病毒的保守基因(E基因和C/pr M基因)2种方法对2012年市场销售的主要国产疫苗产品进行了质量评估,同时将供试疫苗产品置-30℃保存3、6、9、12个月后分别取样测定乙脑病毒(JEV)TCID50效价。结果表明,市售的猪乙脑同类疫苗中不同品牌产品之间活病毒含量差异较大,最高可达104.33TCID50/头份,但部分产品含量极低,甚至难以检测到活病毒;E基因和C/pr M基因的RT-PCR扩增产物丰度的差异与TCID50测定结果基本一致。多数疫苗产品在有效期内病毒效价基本稳定,同一厂家生产的疫苗保存期越短,其中相对活病毒越多,效价越高。     

猪细小病毒PPT1株免疫原性研究

用PPT1株制备猪细小病毒油乳剂灭活疫苗,并将其与市售灭活疫苗免疫豚鼠,定期采集,血清用血凝抑制试验测定抗体效价。试验结果表明,PPT1株在PK-15细胞上病毒增殖效价可达到1.96×106TCID50/mL,两种疫苗二免后14d,抗体效价均可以达到8log2。     

棘胸蛙虹彩病毒免疫方法研究

[目的]研究棘胸蛙虹彩病毒疫苗体表喷雾和肌肉注射的免疫效果,为其免疫方法提供理论依据。[方法]用不同浓度棘胸蛙虹彩病毒灭活疫苗进行体表喷雾免疫和肌肉注射免疫,并进行血清抗体效价检测和相对免疫保护率测定。[结果]注射0.2 m L 1×108TCID50/m L疫苗组21 d血清中和抗体效价最高达到380.2,相对免疫保护率达到80%;体表喷雾1×107TCID50/m L疫苗组,28 d最高抗体效价为320.0,相对免疫保护率为60%。[结论]肌肉注射疫苗和体表喷雾疫苗对棘胸蛙都有较好的免疫效果,肌肉注射疫苗组的免疫效果最佳,但喷雾免疫可作为棘胸蛙快速无损伤免疫的一种有效途径。     

一株猪源乙型脑炎病毒的分离及鉴定

从江苏某发病猪场采集的母猪流产胎儿脑组织样本中成功分离到一株猪源乙型脑炎病毒(JEV)毒株,并对该毒株的相关生物学特性进行了鉴定。利用BHK-21细胞传代和脑内接种小鼠方法,对疑似阳性病料做病毒分离。通过RT-PCR,CPE和IFA等方法对JEV分离株进行鉴定,并测定其TCID50。结果成功分离获得一株JEV毒株(JEV JS01株),该毒株能够在BHK-21细胞上增殖并产生细胞病变,TCID50为每1 m L107.0,免疫荧光检测可观察到JEV特异性荧光。RT-PCR扩增E基因并测序分析表明,与Gen Bank中登录的JEV毒株序列具有较高的同源性,属基因Ⅲ型。小鼠致病力试验表明该分离株对易感动物具有较高致病性。本研究为进一步开展乙脑病毒流行病学与疫苗免疫研究奠定了基础。     

2020-2021年市售马立克病疫苗的效价测定及质量评估

为了解和评估现有鸡马立克病（MD）疫苗的质量,采用间接免疫荧光试验（IFA）对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析,同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR方法分别对禽白血病病毒（ALV）和禽网状内皮组织增生症病毒（REV）的污染状况进行检测。结果表明,在所检测的MD液氮苗中,3批进口或国产的CVI988单价液氮苗之间病毒效价无显著差异,2批不同品牌814单价液氮苗效价差异显著（P<0.05）,2批不同品牌双价液氮苗（CVI988+HVT或814+HVT）病毒效价差异极显著（P<0.01）,但上述全部类型液氮苗产品的病毒效价均大于5 500 PFU/羽份,达到国标规定值2倍以上。然而,4批不同品牌HVT冻干苗的病毒效价均远低于产品说明书标注的2 000 PFU/羽份,仅为83.90～109.50 PFU/羽份。全部MD疫苗产品的ALV和REV检测结果均为阴性,表明这些产品洁净无污染。     

棘胸蛙虹彩病毒疫苗制备及免疫技术

对棘胸蛙虹彩病毒(QSIV)进行疫苗制备,通过细胞盲传培养、无菌检验和PCR检测,确定0.1% β-丙内酯4 ℃灭活72 h、0.2%福尔马林37 ℃灭活72 h、1%二乙烯亚胺37 ℃灭活48 h后制备的疫苗安全有效。将制备疫苗对棘胸蛙进行体表喷雾和肌肉注射免疫后,进行血清抗体效价检测和免疫保护力测定。结果表明,注射0.2 mL疫苗组(病毒滴度为1×10⁷ TCID50·mL^-1)棘胸蛙21 d血清中和抗体效价最高达到380.2,相对免疫保护率达到80%,为最适的免疫途径。60 min喷雾组28 d时的最高抗体效价为320,相对免疫保护率为60%,可作为快速无损伤免疫的有效途径。     

牛病毒性腹泻病毒山东株的分离与鉴定

牛病毒性腹泻病毒是牛病毒性腹泻-黏膜病的重要病原体,该病毒病是极为复杂、呈多临床类型表现的传染病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。本研究从疑似牛病毒性腹泻-黏膜病的粪便中分离得到一株病毒能使MDBK细胞产生细胞病变,经RT-PCR检测及扩增产物测序进一步证实,该病毒为牛病毒性腹泻-黏膜病病毒,TCID50测定该病毒的滴度为107.15TCID50/ml。该病毒株的分离鉴定为牛病毒性腹泻病毒疫苗的研制奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒3种灭活疫苗的制备及免疫效果比较

以GZ0409-31株乙脑强毒株作为抗原与白油佐剂、蜂胶佐剂、603纳米佐剂制备灭活疫苗,并对疫苗做了无菌检验和安全检验,灭活疫苗接种小鼠后均未出现不良反应,安全性良好.将制备的乙脑灭活疫苗免疫小鼠,并且与市售乙脑弱毒活苗作对比.结果显示,白油佐剂灭活苗组和603纳米佐剂灭活苗组在第90d抗体效价还维持在较高的水平,同...     

1株猪源乙型脑炎病毒株的免疫原性研究

将从江苏地区筛选出的1株增殖性能稳定猪源JEV JS01毒株作为疫苗,用毒株制备灭活疫苗进行免疫原性研究。试验采用经过细胞传代获得JEV JS01病毒液(1×10~(7.5)TCID50/m L),以甲醛灭活后加入油佐剂,制备猪源乙型脑炎灭活疫苗。腹腔免疫9~12 g小鼠,攻毒保护结果显示对照组小鼠全部死亡,免疫组90%以上健活。分别肌肉注射免疫仔猪及后备母猪,不同时间采集血清测定JEV ELISA抗体。检测结果显示,免疫后试验猪血清抗体效价较免疫前均有显著提高,后备母猪免疫8个月后抗体仍全部为阳性,抗体水平与免疫剂量呈正相关性。试验表明该猪源乙脑病毒JS01毒株具有良好的免疫原性,可以用作疫苗用毒株。     

广东地区猪群新发塞内卡病毒流行株的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】检测广东两猪场新发的鼻镜与蹄冠水疱病病原,获得新发塞内卡病毒（Senecavirus A, SVA）流行株,为后续研究提供材料。【方法】应用 SVA RT-PCR、荧光 PCR 等方法对采集的病料进行初步筛 查,再将水泡皮进行处理接种于 ST 细胞、BHK-21 细胞上,用 SVA 特异性引物对细胞上清液进行扩增,测序 并分析序列,采用蔗糖浓度梯度方法纯化病毒进行电子显微镜形态观察,并对病毒分离株的 TCID50 进行测定。 【结果】 经 SVA RT-PCR 与荧光 PCR 方法初步诊断该猪群为 SVA 感染;细胞接毒培养发现,自第 6 代起, 细胞出现典型 CPE,电镜观察可见 25 nm 左右的病毒颗粒,扩增序列提交 NCBI Blastn 比对鉴定为 SVA;测得 毒株 SVA CH-GDBL1-2016 的 TCID50 为 106.8,毒株 SVA CH-GDBL2-2016 的 TCID50 为 106.7。【结论】SVA CH-GDBL1-2016 和 SVA CH-GDBL2-2016 可为后续塞内卡病毒病的诊断和疫苗研制提供材料基础。     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10~(5.2)、10~(3.2)、10~(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

猪伪狂犬病毒的增殖、纯化和鉴定

以伪狂犬病毒(PRV)活疫苗Bartha弱毒株接种于幼仓鼠肾细胞(BHK-21)使其增殖,通过PCR方法鉴定了病毒。以组织细胞半数感染剂量(TCID50)对病毒效价进行了评定,利用蔗糖密度梯度离心法纯化了病毒。结果表明,培养的病毒滴度为103.25TCID50/mL,纯化后的病毒经SDS-PAGE电泳显示,获得了较纯的蛋白条带。     

悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。     

混合培养基用于提高犬瘟热病毒在细胞上的效价研究

[目的]探讨高滴度制备犬瘟热病毒（CDV）的方法,对于提高该疫苗的保护率具有重要意义。[方法]选用FK81细胞,分别应用MEM和混合培养基（MEM和DMEM按9∶1的混合物）进行细胞培养和CDV接种,然后对2种培养基下的总细胞数、CDV的半数细胞感染量（TCID50）及电镜下病毒粒子的形态等进行了比较。[结果]混合培养基在总细胞数、TCID50及病毒粒子的形态方面均优于MEM培养基。同时还发现,在测定CDV的TCID50时,酶联免疫吸附试验（ELISA）法较细胞病变（CPE）法更灵敏。[结论]试验所建立的CDV增殖方法,可望用于犬瘟热疫苗的生产实践。     

Ⅰ群禽腺病毒双价油乳剂灭活苗的研究

【目的】提高国内I群禽腺病毒疫苗的防控能力,防止I群禽腺病毒蔓延。【方法】优化I群禽腺病毒的增殖条件,以I群禽腺病毒血清4型（FAV-4）及血清8型（FAV-8）的抗原液制备油乳剂单价及双价灭活苗,比较甲醛及β-丙内酯（BPL）的灭活效果,并检验疫苗性状、监测免疫抗体水平及进行免疫攻毒试验和田间试验。【结果】疫苗灭活以1.00 mL/L终浓度的甲醛或0.500 mL/L终浓度的BPL为宜;3种疫苗均为白色状乳液,4°C下保存期均可达12个月,单价疫苗的最小免疫剂量为100 μL/羽,双价疫苗的最小免疫剂量为250 μL/羽;免疫抗体水平监测结果表明,免疫后第4周抗体水平达到峰值,且在免疫后第8周仍维持较高水平;免疫攻毒试验结果显示,3种疫苗的保护率均为100%,能完全抵抗病毒攻击;田间试验结果表明,在免疫初期3种疫苗抗体均达到预期免疫效果,免疫保护期在6个月以上,在生产中使用双价疫苗可以减少注射次数。【结论】FAV-4、FAV-8双价油乳剂灭活苗免疫效果好、保存期长、安全性好,为净化I群禽腺病毒提供了技术支撑。     

Marc-145细胞微载体悬浮培养及PRRSV增殖工艺的建立

采用分批式培养方法研究了Marc-145细胞微载体悬浮培养及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖工艺。结果表明,在3 g/L的微载体用量下,采用1 ml 3×105个细胞的初始接种密度及培养至第3 d进行换液操作工艺可以获得最佳的Marc-145细胞生长效能。采用感染复数为0.05的接毒比例及接毒后48 h收获毒液可获得最高的PRRSV增殖效价。在5 L反应器中重复验证上述工艺,获得较为稳定的试验结果,最大细胞密度均可高于1 ml 2×106个细胞,PRRSV的增殖效价均高于108.0TCID50/ml。为猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒变异株二价弱毒疫苗的研究

选用传染性法氏囊病病毒变异株JD1、NB、HZ1弱毒株配制成JN（JD1+NB毒株组成）和JH（JD1+HZ1毒株组成）两种二价弱毒疫苗。分别在14日龄首免和28日龄二免SPF鸡,并于一免后14 d、21 d,二免后12 d分别用强毒株传染性法氏囊病病毒（IBDV）BC6/85株攻击;同时观察疫苗的安全性。结果表明JN和JH疫苗均能诱导SPF免疫鸡产生优良的免疫应答反应,并能使免疫鸡对IBDV-BC6/85株的攻击产生100%的保护。JN和JH疫苗的最佳免疫剂量分别为6 000 TCID₅₀和10 000 TCID₅₀。     

一株2型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其在MDBK细胞上的克隆纯化

为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在猪用活疫苗生产过程中的污染情况,利用抗原捕获ELISA方法对用于制作原代睾丸细胞的犊牛血清进行检测。将检测结果为阳性的1份犊牛血清,接种于MDBK细胞上,盲传3代,出现明显细胞病变。用BVDV 5′-UTR端特异性引物进行RT-PCR扩增,并对扩增片段进行克隆测序和序列分析。结果表明,分离得到一株2型牛病毒性腹泻病毒,并将其命名为JN-2。将该病毒用蚀斑方法进行克隆纯化,并对纯化前后病毒的TCID50进行测定比较,结果发现纯化后病毒滴度显著提高。     

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

 【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50?mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。