龙眼TFL1基因的克隆与表达

以‘红核子’龙眼叶芽为材料,克隆了龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的c DNA序列和基因组DNA序列,进行序列分析,并对这两个基因在花芽分化过程中的表达进行了研究.结果显示,龙眼TFL1-1基因c DNA开放阅读框共519 bp,编码173个氨基酸,TFL1-2基因c DNA开放阅读框共525 bp,编码175个氨基酸;两个基因DNA序列均含有4个外显子和3个内含子;序列分析和系统进化树分析表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2都是TFL1同源基因,龙眼TFL1-1基因与柑橘、梨的TFL1基因亲缘关系较近;基因表达结果表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的功能都与抑制花芽分化有关.     

黑木耳内切葡聚糖酶基因克隆与原核表达

克隆了黑木耳(Auricularia auricular-judae)内切葡聚糖酶(endoglucanase)基因并进行序列分析,此外,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。研究基于前期测得的黑木耳转录组数据,同时结合基因组数据(GenBank登录号为NEKD00000000. 1),筛选到黑木耳内切葡聚糖酶基因序列并设计特异引物,以黑木耳菌丝总RNA为模板,采用RT-PCR技术克隆黑木耳内切葡聚糖酶基因c DNA全长,命名为Aa-eg,构建了重组原核表达载体p ET32a-Aa-eg并成功在大肠杆菌中表达。序列分析表明,c DNA全长为1 242 bp,编码413个氨基酸,预测该蛋白分子量为43. 59 ku,理论等电点为4. 42,存在信号肽。由于p ET-32a载体包含20. 0 ku的标签,SDS-PAGE分析在45. 0 ku和66. 2 ku之间出现目的蛋白条带,与理论预期值大小一致。通过对黑木耳内切葡聚糖酶基因的克隆及分析,为进一步揭示黑木耳内切葡聚糖酶基因功能奠定基础。     

洋葱S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及分析

根据洋葱转录组测序结果设计了S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(Ac SAMS)引物,利用RT-PCR技术和RACE技术克隆了洋葱S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的c DNA全长,命名为Ac SAMS。该c DNA全长1 475 bp,ORF为1 191 bp,编码396个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明,Ac SAMS氨基酸序列与紫萼同源性为95%,与短花药野生稻为94%,与桔梗和粳稻为93%。系统发育树结果显示,Ac SAMS与唐菖莆SAMS的亲缘关系最近。该基因的克隆可为进一步研究Ac SAMS在抗旱、抗冻、耐盐等抗逆过程中的作用机理提供理论依据,为开展抗逆基因工程奠定基础。     

苔藓植物DNA条形码的研究进展

[目的]概述DNA条形码在苔藓植物中的研究进展,为将该技术更广泛地用于苔藓植物研究提供参考。[方法]结合DNA条形码技术的发展及其在动、植物研究中的应用,概述了该技术在苔藓植物研究中的现状及研究进展,并呼吁建立专门的机构对苔藓植物进行系统的DNA条形码研究策略,加快苔藓植物的研究。[结果]DNA条形码技术已在动植物研究中得到了广泛的应用,在植物研究中尚未获得理想的被广泛认同的DNA条形码。但研究发现,各种候选片段为苔藓植物分子生物学的发展提供了便利的检测手段。随着该技术的逐步发展完善,其将会在苔藓植物的科学研究中发挥越来越大的作用。[结论]DNA条形码技术是近年来生物学研究的热点,该技术在生命科学、法医学、流行病学、医药及食品质量控制等领域均具有广泛的应用前景,其将极大地促进人类监测、了解以及利用生物多样性的能力。该研究为DNA条形码技术在苔藓植物研究中的应用提供了参考。     

从蒙特卡罗模拟数据与实验运行数据比较来研究阵列性能

对羊八井ARG0实验42个探测器群阵列的运行数据进行了分析,并与用蒙特卡罗方法获得的模拟数据进行比较,对hit触发数、strip pattern和方位角分布这3个阵列性能进行了研究.此外,结合阵列的运行情况,对模拟数据与实验数据比较中出现的差异给出了合理的解释.     

狼山鸡保种群不同世代线粒体COⅠ基因条形码变化规律研究

以0、5、10和15世代狼山鸡保种群为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidaseⅠ,COⅠ)基因全长序列多态性,以分析COⅠ基因DNA条形码在狼山鸡保种群不同世代的变化情况。结果表明,COⅠ基因序列在狼山鸡0和5世代中存在相同的6个突变位点,为4个单倍型;在10和15世代存在相同的3个突变位点,为3个单倍型;4个世代122个个体存在相同的2个突变位点,为5个单倍型,其中106个个体COⅠ基因分布于H2单倍型。狼山鸡0、5、10和15世代COⅠ基因单倍型多样度分别为0.276、0.333、0.119和0.252,平均核苷酸差异(K)分别为0.707、1.083、0.182和0.314,核苷酸多样度(Pi)分别为0.00046、0.00070、0.00012和0.00020。结果说明COⅠ基因DNA条形码在0~15世代间稳定遗传,表明狼山鸡保种群保种效果良好。     

鳞头犬牙南极鱼atp6v0c基因在HeLa细胞中抗寒功能的研究

为探求南极鱼ATP酶类在低温适应下的作用,从鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawsoni的c DNA文库中克隆atp6v0c基因(dmatp6v0c),并转染到He La细胞中,通过流式细胞仪检测细胞在低温胁迫下(10℃)的死亡率,获得了dmatp6v0c基因的全部编码序列,其长度为462 bp,并将其插入到真核表达载体pc DNA3.1(-)上用于体外表达。结果表明,与对照组相比,在低温胁迫下,过表达dmatp6v0c基因的He La细胞死亡率从(19.23±1.87)%显著降低到(8.13±0.04)%(P0.05)。研究表明,在低温胁迫下dmatp6v0c基因过表达能显著降低He La细胞的死亡率,试验结果可为dmatp6v0c基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供理论依据。     

山羊TGFβ_2部分cDNA的扩增和序列分析

在人和小鼠等的 TGFβ2 基因序列基础上 ,选用 1对同源性引物 ,采用反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)技术从山羊卵泡总 RNA中扩增出 2 73bp的 TGFβ2 c DNA片段 ,进行序列测定 ,由此 c DNA序列推出了相应的 TGFβ2 蛋白分子的氨基酸排列。比较了山羊与人、小鼠、大鼠的 TGFβ2 部分 c DNA核苷酸的同源性和氨基酸的相似性 ,核苷酸同源性分别为 91.9% ,87.5 %和 88.6 % ;氨基酸相似性分别为 97.8% ,96 .7%和 96 .7%。     

山羊TGFβ2部分cDNA的扩增和序列分析

在人和小鼠等的 TGFβ2 基因序列基础上 ,选用 1对同源性引物 ,采用反转录 -聚合酶链反应 (RT-PCR)技术从山羊卵泡总 RNA中扩增出 2 73bp的 TGFβ2 c DNA片段 ,进行序列测定 ,由此 c DNA序列推出了相应的 TGFβ2 蛋白分子的氨基酸排列。比较了山羊与人、小鼠、大鼠的 TGFβ2 部分 c DNA核苷酸的同源性和氨基酸的相似性 ,核苷酸同源性分别为 91.9% ,87.5 %和 88.6 % ;氨基酸相似性分别为 97.8% ,96 .7%和 96 .7%。     

鹌鹑MITF基因多态性与羽色性状的关联性分析

本研究以栗羽朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑作为研究对象,选择与羽色性状相关的MITF基因作为候选基因,通过对栗羽朝鲜鹌鹑和北京白羽鹌鹑MITF基因进行DNA测序,在MITF基因上发现3个多态性位点,分别为位于外显子4上的c.589A>G、外显子5上的c.761G>A和3′UTR上的c.2275C>T。位于外显子4上的c.589A>G突变导致赖氨酸转变为谷氨酸。利用不对称PCR-SSCP技术对300只鹌鹑进行基因分型,3个突变位点均发现三种基因型,命名为AA、AB和BB。群体遗传学分析显示,3个突变位点均表现为中度多态（0.25G、c.761G>A和c.2275C>T位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。其中,c.589A>G位点和c.2569C>T位点栗羽朝鲜鹌鹑的3种基因型（AA、AB和BB）的频率分布与北京白羽鹌鹑的3种基因型频率分布有极显著差异（P<0.01）,说明这2个位点与鹌鹑羽色性状之间有显著的关联性。     

DNA芯片技术及其在农业中的应用

DNA芯片 (DNA chips)技术是一种高效、快速和可同时测定基因组成千上万个基因活动的新方法,能用于揭示所有的基因转录表达层次上的信息。 DNA芯片技术是美国的 Affymetrix公司于 1994年首先发明的。它的迅猛发展和优越性引起了生命科学领域的普遍重视。 一、 DNA芯片技术 　　DNA芯片又称基因芯片 (Gene chips)或 DNA微集阵列 (DNA microarrays)等,它是指包被在固相载体上的高密度 DNA的微点阵。微点阵是指 DNA样品的有序排列,它包括直径为 200μ m或更小的数百至数千个点,每个点为特定序列的 cDNA或寡聚核苷酸。它交叉…     

鸡柔嫩艾美耳球虫免疫调节型DNA疫苗pEtK2-IFN-γ的构建

利用DNA重组技术,分别构建pVAX1-pEtK2、pcDNA4.0(c)-pEtK2、pVAX1-pEtK2-IFN-γ、pcDNA4.0(c) -pEtK2- IFN-γ DNA疫苗载体.重组质粒肌肉注射14日龄鸡,1周后肌肉注射部位组织切除和裂解,通过RT-PCR,Western- blotting 检测保护性抗原在肌肉中表达情况.结果表明,鸡柔嫩艾美耳球虫pEtK2表面抗原基因和鸡IFN-γ基因均能在注射部位肌肉成功表达,这为鸡球虫DNA疫苗的研制奠定了基础.     

文昌鸡白麻羽性状与 SLC45A2 多态性关系

【目的】研究文昌鸡白麻羽性状的遗传规律,鉴定与白麻羽性状相关的基因变异,为文昌鸡白麻羽群体的利用以及白麻羽性状的分子标记辅助选择提供参考。【方法】利用正反交试验探索白麻羽性状的遗传规律;根据白麻羽性状的特点结合前人研究结果,选取SLC45A2基因为候选基因,利用重测序的方法筛选外显子区域内的变异;并重点验证外显子区域的错义突变和无义突变与白麻羽性状的关系。【结果】黄麻羽个体与白麻羽个体正反交试验结果表明,白麻羽性状相对于黄麻羽呈伴性隐性遗传。试验以白麻羽和黄麻个体为DNA模板,扩增了SLC45A2上的7个外显子区域,结果共筛选到5个SNP,其中3个位于外显子上,2个为错义突变(c.a74g和c.g1154c),1个为同义突变(c.c561t)。以文昌鸡白麻羽群体的文昌鸡和非白麻羽性状的文昌鸡、霸王山鸡、清远麻鸡、杏花鸡、红色原鸡为材料,验证上述错义突变,结果显示c.g1154c位点与白麻羽性状完全连锁。【结论】白麻羽性状呈现伴性隐性遗传,c.g1154c可能是白麻羽性状的致因突变。     

毛木耳子实体发育相关cDNA差异显示分析

以毛木耳菌丝、耳基和耳片为供试材料,采用3’-c DNA限制性片段展示方法,获得3个阶段c DNA表达谱,对大于100 bp的18个c DNA片段使用blastx程序与非冗余蛋白数据库(non-redundant protein sequence)进行同源性比对。结果表明,有6个序列能够分别与NCBI数据库中的新孢子虫假定蛋白、水霉菌Aphanomyces invadans蛋白TAR1、微绿球藻核糖体RNA反义转录序列、双孢蘑菇、糙皮侧耳、皱木耳假定蛋白匹配蛋白质相匹配,并且E值≤5×10-8,表明序列匹配良好,实验方法可行,能够作为毛木耳等食用菌功能基因研究手段之一。     

氯虫苯甲酰胺干扰桃小食心虫交配的转录组分析

【目的】探明氯虫苯甲酰胺处理后桃小食心虫(Carposina sasakii)成虫的转录组差异,了解该药剂影响桃小食心虫交配的基因在功能分类和代谢通路等方面的生物学特征,挖掘与交配相关的功能基因。【方法】通过生物学实验观察氯虫苯甲酰胺干扰桃小食心虫成虫交配及繁殖情况。采用Illumina Hi SeqTM2500高通量测序技术对刚羽化的桃小食心虫雌雄成虫、羽化后4—6 h进入交配高峰期的雌雄成虫和经氯虫苯甲酰胺处理4—6 h的雌雄成虫进行转录组测序,利用Trinity软件对所得序列进行de novo组装及评估,之后对获得的有效序列进行功能注释,并利用q RT-PCR技术分析氯虫苯甲酰胺处理后相关基因的时空表达变化。【结果】氯虫苯甲酰胺处理后,桃小食心虫的交配率显著降低,寿命缩短,产卵量减少。通过合并组装桃小食心虫转录组有效序列共获得102 831条unigene,其中34 526个有注释信息。根据筛选标准,氯虫苯甲酰胺处理过程中,雌雄虫中分别有122个和147个基因发生变化,其中相同差异基因31个。对所存在的234个差异基因进行GO功能注释和富集分析结果显示,分子功能过程中的催化活性和结合活性及生物学过程中与代谢过程、单一生物体过程和细胞过程相关的5类基因占主导地位。KEGG分类结果显示,富集到代谢通路的最多,有25个,包括昆虫激素合成、药物代谢等。通过比对分析,鉴定c64662.graph_c0为桃小食心虫鱼尼丁受体基因,其长度为15 637 bp,与已报道Cs Ry R的一致性为99.0%。此外,在234个差异基因中,鉴别羧酸酯酶unigene 3个、细胞色素P450 unigene 4个、肌钙蛋白unigene3个、气味结合蛋白unigene 1个和生物钟unigene 1个。细胞色素P450 c40709.graph_c0参与昆虫激素生物合成。根据转录组中基因表达分析,12个基因在雌雄虫中的表达均出现不同变化趋势。q RT-PCR结果显示,氯虫苯甲酰胺诱导羧酸酯酶c51998.graph_c0基因上调表达;药剂处理后,雌雄虫的c57480.graph_c0和c53794.graph_c0的表达分别呈现显著的上调和下调变化,而c40709.graph_c0基因仅在雄虫中显著下调,处理6 h后c53281.graph_c0只在雌虫中上调表达;氯虫苯甲酰胺处理后3个肌钙蛋白基因在整个试验阶段均表现明显的下调趋势;雄虫中的生物钟unigene c60883.graph_c0和气味结合蛋白unigene c45675.graph_c0的变化趋势较为一致,进入暗期后立即上调,但均受氯虫苯甲酰胺的抑制。雌虫体内Ry R的表达量显著上调,而雄虫初次到达求偶高峰期前Ry R的表达量与对照差异不显著,到第2个求偶高峰期时,Ry R表达显著下调。除细胞色素P450c57480.graph_c0、c40709.graph_c0和c53281.graph_c0外,其余基因在雄虫中的表达均高于雌虫。且触角酯酶基因c54944.graph_c0、生物钟基因c60883.graph_c0和气味结合蛋白基因c45675.graph_c0在黑暗光照交替变化时,表达发生明显地上调或下调。【结论】通过转录组测序发现氯虫苯甲酰胺干扰桃小交配的作用机制是由靶标基因、嗅觉相关基因、代谢基因、生物钟基因等相互作用引起的。     

甜瓜CmERFIV-5基因cDNA的克隆·表达分析及载体构建

[目的]研究甜瓜Cm ERFIV-5基因的克隆、表达分析及超表达和RNAi载体构建。[方法]根据Gen Bank上登录的甜瓜一个乙烯应答因子(ethylene responsive facter,ERF)基因c DNA序列(登录号:MELO3C024315)设计合成特异性引物。应用RT-PCR技术从甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumismelo L.cv.Hetao)成熟果实中克隆得到该基因c DNA序列,命名为Cm ERFIV-5,分析了该基因在甜瓜根、茎、叶及果实发育过程中的表达特性,将其构建到过量表达载体p PZP221中,得到重组植物表达载体p PZP221-Cm ERFIV-5。同时,构建了该基因RNAi载体p ART-27-Cm ERFIV-5。[结果]序列分析显示,所克隆的c DNA长度为808bp,编码255个氨基酸。荧光实时定量PCR分析表明,Cm ERFIV-5基因在甜瓜根、茎、叶及不同发育时期的果实中均有表达,在叶片中表达量最高。[结论]构建了Cm ERFIV-5基因的过量表达载体与RNAi载体,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

单粒微米珠-单根DNA复合物的微流控分离初步研究

定点单分子DNA芯片有重要用途,但其制备极具挑战性,用光镊、磁镊及原子力显微镜等方法分离单分子DNA,为此建立的平台设备昂贵,且分离效率太低,难以满足实验要求。本研究采用微流控技术,在层流基础上电泳分离与富集单粒微米珠-单根DNA的复合物,旨在为基于微米孔阵列承载这种复合物的定点单分子DNA芯片的制备提供样本。此技术的完善将为单分子DNA芯片制作开辟新的途径。     

常规PCR法扩增口蹄疫病毒基因组5’端序列的探索

【目的】扩增口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)基因组5’端序列,为获得基因组全长准备基础。【方法】将FMDV O/Akesu/58 CE39A株液氮冻存基因组RNA反转录三次,对c DNA的5’端序列进行扩增、克隆、测序。【结果】以c DNA1与c DNA3为模板,用LA Taq DNA polymerase、EX Taq DNA polymerase、Prime STARHS DNA polymerase及3对引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均未扩增出5’端目的片段;以c DNA2为模板,用LA Taq DNA polymerase为扩增酶,两对引物Ⅰ、Ⅱ均能扩增出5’端目的片段,且所测得的序列长度787 bp、797 bp与参考序列核苷酸同源性分别为86.2%和86.3%。【结论】常规PCR法扩增5’端序列较其它技术具有价格便宜、操作简便等优点,但扩增成功率偏低。试验共进行了72次PCR,成功率为6/72,说明FMDV 5’端序列的扩增难度大,应合理设计反转录引物和扩增引物。为许多RNA病毒反向遗传学研究提供了更多的选择。     

黄体素和β-胡萝卜素在肉鸡消化道吸收和代谢过程中的相互影响

利用瘘管技术研究黄体素 (lutein)和 β 胡萝卜素 (βc)在肉鸡消化道吸收、代谢过程中的相互影响。实验分为两大组 :Ⅰ组为研究 βc对肉鸡肠道吸收、代谢lutein的影响 ,lutein与 βc的质量比分别为 4 0 0∶0 (对照组 )、4 0 0∶2 0 0、4 0 0∶4 0 0 ;Ⅱ组为研究lutein对肉鸡肠道吸收、代谢 βc的影响 ,lutein与 βc的质量比分别为 0∶4 0 0 (对照组 )、 2 0 0∶4 0 0、 4 0 0∶4 0 0。结果发现在肠道吸收过程中lutein和 βc没有相互影响 ;lutein在黏膜细胞中的滞留量随灌注液中 βc含量的增加而提高 ,并在 βc添加量为 4 0 0 μg时达到显著水平 (P <0 0 5 ) ;添加lutein后 ,黏膜细胞中 βc的含量极显著提高 (P <0 0 1) ,维生素A的水平极显著下降 (P <0 0 1) ;βc的添加使血浆中lutein的水平极显著降低 (P <0 0 1) ;同样血浆中 βc和维生素A的含量因lutein的添加而极显著下降 (P <0 0 1)。