伪狂犬病病毒IE180基因的研究进展

伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是疱疹病毒科a疱疹病毒亚科的成员，临床上引起Aujeszky氏病（Aujeszky＇s disease，AD）。根据该病毒感染细胞后DNA转录、表达时间的先后可将PRV基因分为立即早期基因（immediate—early gene，IE），早期基因（earlygene）和晚期基因（late gene），这3种基因产物以瀑布方式调节。现已证实伪狂犬病病毒只含一个立即早期基因——IE180基因，该基因对病毒在动物体内的复制至关重要，只有IE180基因开放转录、并翻译成IE180蛋白，其下游的基因才能在IE180蛋白的激活作用下得以完全开放转录，否则病毒复制将不能完成。IE180基因的表达产物IE180蛋白是一个多功能蛋白，不仅能激活同源蛋白基因启动子，而且能激活某些异源蛋白基因启动子。此外，IE180蛋白还具有诱导机体产生免疫保护的功能。IE180的转基因小鼠能够抵抗PRV的攻击，但最近发现IE180在小鼠体内的表达会导致小鼠小脑发育异常，表现出共济失调、震颤等症状。     

马疱疹病毒1型调控蛋白对SV40早期启动子的调控

为研究马疱疹病毒1型(EHV-1)6种调控蛋白(极早期调控蛋白IEP、早期调控蛋白EICP0、EICP22、EICP27、IR2P和晚期调控蛋白ETIF)对猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(SV40EIp)的调控作用,本研究将这6种EHV-1调控蛋白真核表达重组质粒分别与SV40EIp萤火虫荧光素酶重组报告质粒共转染RK13细胞,并同时转染作为内控的海肾荧光素酶报告质粒,通过检测两种独立的报告酶与对应底物反应后的发光强度,得到SV40EIp活性相对值。从而评价EHV-1 6种调控蛋白对SV40EIp活性影响。结果表明:ETIF对SV40EIp活性影响不显著;IR2P对SV40EIp活性具有下调作用;IEP、EICP0、EICP22、EICP27对SV40EIp活性均具有上调作用;而对于含增强子的SV40EIp(SV40EIp E),这4种调控蛋白也能够上调SV40EIp E活性,其中EICP22上调作用最强。而且,EICP22和EICP27能够协同上调SV40EIp的活性。此外,EICP22与EHV-1早期基因启动子转录因子TBP、EICP27与TBP及EICP22与EICP27的免疫共沉淀试验(Co-IP)结果表明:仅EICP27可以与TBP发生相互作用,提示EICP22并非与EICP27或者TBP直接结合而实现协同上调作用,其协同上调作用还存在其他的作用方式。     

伪狂犬病病毒IE180基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

提取伪狂犬病病毒国内地方分离株Ea株基因组DNA,BamH I酶切后回收4.8kb左右的片段,克隆到pUC18中,酶切分析和部分序列测定筛选到含IE180基因的重组质粒pUCIE.进一步将长约1.8kb的IE180基因5′端部分编码区亚片段克隆到原核表达载体pET-28a中,使其置于pET-28a的T7启动子下游并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag融合,重组表达质粒pET1.8转化BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,相对分子质量为62 000,同预期大小相当,并能同抗6×His的抗体发生特异性反应.     

伪狂犬病病毒通用转移载体的构建及应用

将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。     

水貂TYRP1基因启动子活性和Sp1结合位点

以同源性较高的雪貂TYRP1基因序列(GenBank:NW_004569257.1)为模板,通过PCR扩增7个不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-Basic载体中,利用脂质体转染到A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测活性,利用多个在线软件分别分析启动子区活性及转录因子结合位点,并构建突变体进行活性验证。结果显示:成功构建7个不同长度的启动子缺失片段重组质粒,其中6个片段具有明显的启动子活性。-367/+70区域为水貂TYRP1基因核心启动子区域,-367/-144区域的缺失,启动子活性无明显变化,-144/-37区域的缺失使启动子活性明显下降,表明该区域可能存在正调控元件。通过生物信息学方法预测可能存在Sp1转录因子结合位点,构建的Mut-Sp1-2突变体活性明显低于野生型pGL3-215,差异极显著(P0.01)。结果表明:成功筛选了水貂TYRP1基因核心启动子区域(-367/+70),确定Sp1(-56/-45)结合位点为转录的正调控区域。     

绿色荧光蛋白在家蚕细胞中的表达

利用家蚕细胞质肌动蛋白基因（A3）启动子和NPV病毒即刻早期蛋白IE启动子在家蚕细胞中表达GFP，实验结果表明是可行与有效的。     

猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gⅠ）基因转移载体质粒的构建

用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ（gE）和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7－1DNA后。回收大小约6.0kb片段，经T4DNA连接酶接后转化入大肠杆菌DH5α株，得到含gp63片段的转移载体质粒PP63，再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β－半乳糖苷酶（LacZ）基因作为报告基因，将其手稿P63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点，在选择培养基中筛选出表达β－半乳糖苷酶的转化子，构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒，命名为PP63LacZ。在该转移载体质粒中，LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连，经酶切、核酸分子杂交技术鉴定，结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。     

伪狂犬病病毒IE180基因启动子缺失克隆的构建与鉴定

在本实验室已有的PRV JS-2012感染性克隆pBAC-JS2012及突变筛选菌株SW102-PRVBAC基础上,利用galk正筛选和卡那霉素的筛选标记基因,构建IE180两个拷贝启动子均删除的缺失克隆.利用同源重组将galk表达盒替换掉IE 180TATA-box及左边297个碱基和右边172个碱基,经PCR鉴定和...     

表达3个外源基因真核表达载体的构建

为构建可以同时表达3个外源基因的真核表达载体,本实验以pCAGGs载体为骨架,引入SV40启动子及单疱疹病毒(HSV)TK基因的polyA序列,并且在β-actin启动子下游插入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建了能够同时表达3个外源基因的真核表达质粒pCAGGs-IRES.本研究将PR8流感病毒的M基因、绿色荧光蛋白基因EGFP及H1N1猪流感病毒的HA基因,分别克隆于pCAGGs-IRES载体的3个启动子下游,转染细胞后,通过间接免疫荧光和western blot表明本实验构建的pCAGGs-IRES载体能同时表达3个外源基因.该载体有望为基因疫苗、基因操作及蛋白质相互作用等研究提供新的真核表达载体.     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA在BHK21细胞中的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞,ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别是５２．８μｇ／Ｌ和７０．４μｇ／Ｌ。     

绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种重组质粒直接注射于小鼠骨骼肌,观察了ｔ－ＰＡ基因在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验结果显示,注射重组质粒ＤＮＡ后,第５天凝血时间有所延长,第１５～２０天达到高峰,小鼠体外凝血时间平均延长７ｍｉｎ左右,延长时间与基因注射量呈明显的正相关。     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。     

5'端非病毒核苷酸对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆拯救的影响

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID₅₀/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID₅₀/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。     

中国流行株ＨＩＶ—1gag—gp120与ＩＬ／ＩＬ—６共表达核酸疫苗质粒的构建和

以pcDNA3.１( ）为载体，构建了中国流行株ＨＩＶ－1gag-gp1２０嵌合基因的核酸疫苗质粒；并以pIRES1neo为载体，构建了gap-gp120与ＩＬ－２／ＩＬ－６共表达的２种核酸疫苗质粒。将核酸疫苗质粒在体外转染ＢＨＫ－２１细胞，ＥＬＩＳＡ方法检测到３种核酸疫苗质粒均表达了目的ＨＩＶ－１结构蛋白。将核酸疫苗质粒免疫小鼠，免疫学指标检测结果表明，在本实验条件下，未能检测到含有gap-gp120的核酸疫苗质粒免疫鼠的细胞免疫和体液免疫功能的明显改变；而与ＩＬ－２／ＩＬ６共表达的２种核酸疫苗质粒使免疫鼠ＣＤ^ 4、ＣＤ^ 8T细胞数量明显升高，ＣonA和ＬＰＳ诱导的细胞增殖能力显著增强，ＣＴＬ活性明显提高，表明ＩＬ－２和ＩＬ－６有效地发挥了免疫佐剂作用。     

含鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因重组火鸡疱疹病毒的构建

采用PCR方法，以传染性贫血病毒(CIAV)DNA为模板，扩增并克隆了CIAV的VP1、VP2基因，并进行了序列分析。经基因修饰，将这两个基因分别加上表达元件后连接作为目的基因。通过同源重组技术，将目的基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)gC基因区，构建了一株含CIAV VP1、VP2基因表达单元的重组HVT(VP1VP2-rHVT)：体内、体外传代结果表明该重组病毒性状稳定。采用PCR扩增及Southem blot杂交检测，证实了CIAV VP1、VP2基因的插入。     

鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白基因启动子活性分析

PCR扩增鸡L-FABP基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,进行克隆并测序,构建了鸡L-FABP基因报告基因系列缺失载体,瞬时转染进入人肝癌细胞系,利用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性。在线分析软件发现鸡L-FABP基因启动子区存在HNF-1、SREBP-1、AP-1、C/EBP、Oct-1、TATA、CCAAT、GATA-1等调控元件,没有发现CpG岛。报告基因结果表明鸡L-FABP基因启动子-2 076bp/-20bp区域具有最强的启动子活性,-522bp/-20bp区域启动子活性最弱;C/EBPα可以显著的抑制鸡L-FABP基因的表达,这些结果为深入研究鸡L-FABP的表达调控机制奠定了基础。