EPSPS基因克隆及其表达载体的构建

[目的]克隆大豆EPSPS基因并构建其表达载体,为培育抗草甘膦作物提供理论基础和技术储备.[方法]以抗草甘膦大豆总基因组为模板,扩增EPSPS基因,构建EPSPS基因的植物表达载体PCAMBIA1300-UBI-GFP-EPSPS,并导入农杆菌,使其能够进行作物的遗传转化.[结果]扩增获得EPSP基因全长1368 bp,共编码455个氨基酸.测序结果表明,其与GenBank(AF464188.1)中已知的CDS序列完全一致,成功构建了EPSPS值物表达载体,并将其导入农杆菌菌株EHA105中.[结论]构建的表达载体可用于甜高粱等单子叶作物抗草甘膦性状的遗传改良.     

EPSPS基因的克隆及油用亚麻表达载体的构建

以抗草甘膦油菜基因组DNA为模板,PCR扩增抗草甘膦油菜的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因,构建植物表达载体pBI121-EPSPS,并导入农杆菌进行检测.结果表明:扩增获得EPSPS基因全长1 377bp,共编码459个氨基酸.测序结果表明,其与美国Monsanto公司获得的专利(US5633435)中已知的CDS序列完全一致,表明成功构建了EPSPS植物表达载体,并将其导入农杆菌菌株LBA4404中.     

分别转CP4 EPSPS和aroA基因拟南芥对草甘膦的抗性

杂草和农作物竞争水分、养料以及光照,增加农业生产成本,影响农作物的产量和品质,利用化学方法来控制杂草已成为现代农业不可缺少的一部分.     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

用根癌农杆菌介导EPSPS基因遗传转化拟南芥的研究

研究通过花序浸染法,NEPSPS因导入拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col（Columbia）生态型植株中,通过卡那霉素对种子的抗性筛选及常规PCR对再生植株进行阳性鉴定。初步证明,EPSPS基因已经成功转化拟南芥,经过反复筛选,获得转基因纯系植株。     

玉米抗草甘膦基因(sxglr-11)的构建与表达

将现有的抗草甘膦基因(sxglr-11)和带有Ubiquitin启动子的载体进行连接,用壮观霉素(spectino-mycin)抗生素标记,构建携带抗草甘膦基因(sxglr-11)的大肠杆菌。然后利用三亲杂交法,将构建的真核表达载体转入根瘤农杆菌菌株LBA4404。对菌落进行PCR检测以及质粒双酶切产物进行电泳检测,并用构建的工程菌转化玉米试管苗。研究结果表明,表达载体成功转入根瘤农杆菌LBA4404。     

新的抗草甘膦转基因棉花获得的初报

抗除草剂棉花的培育具有重要的农业生产利用价值。以常规棉花材料为受体,对转化受体的愈伤和幼苗进行草甘膦抗性浓度梯度的筛选试验;在此基础上,利用自主知识产权的草甘膦基因进行多抗草甘膦转化试验,获得了具有草甘膦抗性的棉花再生植株。PCR检测结果表明,该基因已被成功转入棉花受体基因组中。该研究结果可为后续抗草甘膦棉花的选育研究提供必要的新种质资源。     

含抗草甘膦CP4-EPSPS基因和耐逆Trihelix类转录因子GmGT-2A基因的植物表达载体构建及转化验证

高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体p BA002为基础载体,使用抗草甘膦CP4-EPSPS基因替换原载体的Bar筛选标记基因,获得新的植物表达载体p ES002。将大豆耐逆相关Trihelix类转录因子Gm GT-2A连接到p ES002,构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基因的植物表达载体p ES002-Gm GT-2A。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,并对转基因植株进行抗草甘膦和耐盐性鉴定。结果表明,转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照,表明该载体可以用于转基因相关的基因功能研究。     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

An Altered aroA Gene Product Confers Resistance to the Herbicide Glyphosate

The hypothesis that the herbicide glyphosate (N-phosphonomethylglycine) acts on plants and microorganisms by inhibiting synthesis of 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate, a precursor to aromatic amino acids, was tested. Salmonella typhimurium was treated with ethyl methanesulfonate, and mutants mapping at the aroA locus, which encodes 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, were isolated by selection for glyphosate resistance. One of the mutants results in the synthesis of a 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase that is resistant to inhibition by glyphosate. The mutant aroA gene and the corresponding wild-type allele were cloned. The mutation confers high resistance to glyphosate when introduced in Escherichia coli in the presence or absence of the wild-type aroA allele.     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

转基因抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

为了明确转基因抗草甘膦棉花10-6001对除草剂草甘膦的耐受性,以转基因抗草甘膦棉花材料10-6001和常规棉花品种冀棉958（ CK）为试验材料,在棉苗6片真叶时叶面喷施不同浓度〔0（不喷施除草剂,人工除草, CK）、0.25％和0.50％〕的草甘膦溶液,分别于施药后0（当天下午）、1、7、14和21 d调查棉花的株高、药害级别、受害指数和死苗率,施药后35 d 调查棉花的死苗情况;分析2种棉花对不同浓度草甘膦的反应程度,并对其株高差异进行了显著性方差分析。结果表明：转基因抗草甘膦棉花品系10-6001对草甘膦的耐受性很好,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花在整个试验期间药害均较轻,表现为植株矮化,生长减慢,叶片略变小,且无死苗,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均不显著;随着时间的延长,药害逐渐缓解。而常规品种冀棉958对草甘膦的耐受性很差,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花药害症状表现为植株矮化,生长缓慢,叶片变小、枯黄、褐化干枯,并且药害程度随着时间的延长而加重,药害级别和受害指数均高于10-6001,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均达到了极显著水平,施药后35 d部分棉花出现整株枯死。     

核黄素合酶基因RNAi表达载体的构建

根据拟南芥RS基因的编码序列设计引物,利用PCR技术从pGADT7-RS重组质粒上扩增到RS基因编码区476 bp片段。利用双链RNA介导的基因沉默技术,构建RS基因沉默表达载体,为进一步研究该基因在植物与蛋白激发子HpaGXoo互作中的功能及其作用机制奠定基础。首先将RS基因片段连接到pUCm-T载体上,用Pst I/BamH I和Pst I/Xho I分别对pUCm-RS重组载体进行酶切,得到2个RS基因片段;先后将其连接到用相应限制酶酶切的pBSSK-in载体上,构建成pBSSK-RS-in-RS重组载体,该重组载体中的2个RS片段大小一致,反向重复;最后用Sac I/Kpn I酶切pBSSK-RS-in-RS载体得到RS-intron-RS片段,连入表达载体pCAMBIA1301中,构建成该基因的沉默表达载体。     

牛筋草对草甘膦的抗药性

【目的】明确广东省果园或菜田田埂牛筋草（Eleusine indica）对草甘膦（glyphosate）的抗药性水平。【方法】利用整株测定法测定广东省广州市、惠州市、梅州市等地共7个点牛筋草对草甘膦的抗药性水平;采用紫外分光光度计测定抗性水平差异最大的2种牛筋草体内莽草酸含量的差异;采用光纤型双通道PAM-100测定抗性水平差异最大的2种牛筋草叶片各自叶绿素荧光参数的差异。【结果】惠州市杨村番石榴园（以下简称杨村）牛筋草对草甘膦的相对抗性指数达11.0,试验结果与田间实际反映情况相吻合;莽草酸含量测定结果表明,1 845 g a.i./hm2草甘膦处理后0-7 d,杨村牛筋草植株内部莽草酸含量较低,与对照相当,而广州番禺牛筋草植株内部积累了较多莽草酸,草甘膦处理后7 d,其莽草酸含量（623.1 µg•g FW-1）为杨村牛筋草（68.1 µg•g FW-1）的9.1倍;叶片荧光参数结果表明,杨村牛筋草Fv/Fm（PSⅡ最大原初光能转化效率）、α（PSII光响应曲线的初始斜率,代表了植物对光能的利用效率）值均高于广州番禺牛筋草,且值较稳定,而广州番禺牛筋草Fv/Fm和α在草甘膦处理5 d后均降为0。【结论】广东省部分果园或菜田田埂牛筋草对草甘膦已产生不同程度的抗药性,其中杨村牛筋草抗性最高;杨村牛筋草体内积累的莽草酸很低,植株光合系统基本未受到影响,光合作用正常进行。     

转基因抗草甘膦棉花及其对草甘膦抗性的时空表达

草甘膦是一种非选择性除草剂,它通过竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干扰芳香族氨基酸的生物合成而发挥毒性作用。虽然获得抗草甘膦棉花的途径有多种,但当前用于生产的抗草甘膦棉花主要是以CP4-EPSPS基因转化棉花获得的。草甘膦对转CP4-EPSPS棉花的营养生长没有不利影响,但4叶期后喷施草甘膦会显著降低花粉粒的活性,抑制散粉、授粉和结实,导致转CP4-EPSPS棉花对草甘膦抗性呈现出一定程度的时空变化。草甘膦对抗草甘膦棉花(雄性)生殖器官的抑制效应一方面源于草甘膦在生殖器官内的大量积累,另一方面在于CP4-EPSPS基因在(雄性)生殖器官的低效表达。促进CP4-EPSPS基因在全株高效表达是提高棉花对草甘膦抗性的重要途径。     

一种新的草甘膦氧化还原酶基因的克隆及活性蛋白表达研究

本研究构建了一个草甘膦污染土壤的宏基因组文库,利用草甘膦抗性筛选方法从该文库中筛选得到一个草甘膦抗性克隆,测序结果表明,其上存在一个草甘膦氧化还原酶(glyphosate oxidoreductase,简称GOX)的编码基因,命名为goxA。该基因长为1 296 bp,编码一个由431 aa组成的蛋白质。goxA碱基序列与已报道的gox相差6个碱基,编码产物GOXA与GOX蛋白质氨基酸序列相差2个氨基酸。为了验证GOXA的功能,对其进行了原核表达与纯化,活性电泳结果表明,GOXA具有明显的草甘膦氧化还原酶活性,goxA的发现为草甘膦抗性植物的研发提供具有潜在应用价值的基因资源。     

生物测定法测定棉田牛筋草对草甘膦的抗药性

为了明确湖南省棉田牛筋草对草甘膦的抗药性情况,在采集各地棉田牛筋草种子的基础上,采用室内生物测定法测定了其对草甘膦的抗药性水平。结果表明:采自常德澧县和常德桃源的牛筋草种群的相对抗药性倍数均较高,分别为10.21和7.79,处于中等抗性水平;采集自湘西慈利的牛筋草种群的相对抗性倍数为4.60,处于较低抗性水平;而采集自益阳桃江等地的牛筋草种群的相对抗性倍数均处于1~3。由此表明在湖南省棉花部分产区的牛筋草种群已经产生了对草甘膦的抗药性。     

Development of Transgenic Glyphosate-Resistant Rice with G6 Gene Encoding 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase

Glyphosate-resistant crops have been a huge economic success for genetic engineering. The creating of new glyphosate-resistant plants would increase the available choices for planting and lower the price of genetically modified crop seeds. A novel G6 gene from Pseudomonas putida that encoded 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) was previously isolated. The G6 gene was transfected into rice via Agrobacterium-mediated transformation. The transgenic rice obtained was confirmed by PCR, Southern, and Western blots. The lab experiment and field trials further confirmed that the transgenic rice can survive glyphosate spraying at a dose of 8 g L⁻¹. In contrast, conventional rice was killed at a weed control glyphosate spray dose of 1 g L⁻¹. Altogether, the present study showed that the G6 gene works well in rice in vivo for glyphosate-resistance.     

甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因的克隆及系列表达载体的构建

采用RT-PCR法,从表现玉米矮花叶病症状的玉米叶片中克隆了外壳蛋白(Coat protein)基因。测序和同源性比较结果表明:所克隆的CP基因来自甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)MDB株系,编码219个氨基酸。以CP基因为目的基因,构建了用于基因枪转化的p35SCPfBar,p35SCPrBar,pUbiCPfBar,pU-biCPrBar 4个表达载体和用于农杆菌转化的pCAMBIACPf,pCMABIACPr 2个表达载体。