牛FABGL基因的分离与染色体RH定位

以中国西门塔尔牛血样为材料,提取基因DNA,运用同源序列克隆技术对牛FABGL基因DNA序列进行了克隆与分析,应用SUNbRH7000型辐射杂种板（RH）对分离的牛FABGL基因进行了染色体定位。结果显示,本研究所获得的长为1 925 bp的DNA序列为牛FABGL基因的包含全部9个外显子的基因组序列。该序列与人（NM-014234）和猪（AF-146398）的FABGL基因序列的相似性分别为84%和90%;牛FABGL基因被定位于牛的23号染色体上,与该染色体上的标记BM47的距离为1.71 cR,两点评分值为31.05。     

鉴别牛早期胚胎性别PCR方法引物的设计与筛选

根据牛Y-染色体特异重复序列、睾丸特异蛋白基因以及性别决定基因序列设计合成5对公牛Y-染色体特异引物，依据牛骨胳肌α肌动蛋白前体基因和微卫星DNA序列设计合成4对牛DNA特异引物(内标引物)。单重PcR扩增牛基因组DNA，筛选出4对牛Y-染色体特异引物和1对牛DNA特异内标引物。将不同的Y-染色体特异引物与内标引物组合，多重PCR扩增牛基因组DNA、已知性别的牛成纤维细胞和克隆胚胎，筛选出2个可用于牛早期胚胎性别鉴别的PCR引物组合：B34／A12和B78／A12。     

转基因克隆牛外源基因整合位点的检测

确定外源基因的整合位点是获得转基因动物后的首要任务。本试验应用TAIL-PCR得到了2头转入人溶菌酶基因克隆牛外源基因的整合位点,结果表明:2头转基因个体中外源基因均整合在受体基因组上,其中WS个体外源基因整合在牛24号染色体的基因组克隆（NW₀03104566.1）中。YW个体中外源基因整合在牛16号染色体的基因组克隆（NW₀03104440.1）中,整合位点位于LOC10030和RGL1基因之间。综上表明,在WS和YW个体中,外源基因的整合分别造成受体染色体238和228bp核苷酸的缺失。4个整合片段（InS1^InS4）的末端均与拓扑异构酶I作用位点的共有序列相连。在WS个体中外源基因与染色体的整合连接处（InS1^InS3）存在1nt的同源序列。在整合片段InS2、InS3、InS4中表现出共同的相似处,即均存在具有间隔的短的同源序列。     

应用牛EST数据和人类基因组序列定位100个牛基因特异性标记

评价了应用牛 EST数据和人基因组序列来完善牛的全基因组或特异染色体连锁图谱的方法。根据牛的 EST序列设计引物来扩增牛的相应基因 ,而根据人基因组序列来设计引物扩增侧翼内含子 ,以此来增加片段长度而利于测序。以此方式得到序列标签 (STS) ,然后在 MARC(美国家禽研究中心 )的 4公畜的参考家系中检测 SNP(单核苷酸多态 ) ,根据 SNP多态来定位相应的基因。通过此方法及 SNP质谱基因分型系统 ,我们在牛的遗传图谱上定位了 10 0个EST,其中 70个是从牛 EST-人基因组比较图中随机挑选的。另外 30个位于牛 19号染色体上 ,将牛 19号染色体同源序列 (BTA19)作图到相应的人类 17号染色体 (HSA17) ,表明基因间距离和次序均有明显差异。共有 80 %的成功扩增子发现 SNP,表明这是一个有效的、基于 EST的遗传标记方法。我们证明了基于 SNP和 EST构建连锁图谱的可行性 ,及利用 EST、比较作图信息、人类序列数据来挖掘牛基因组中的 SNP的合理性。     

牛X染色体的辐射杂交图（BTAX）

本研究构建了一个详尽的牛X染色体辐射图谱，其含有微卫星和表达基因在内的20个新标记。以5000rad处理90个杂交细胞系，构建了全基因组辐射杂交板。各个标记的保留频率范围从XIST基因的7％～8％到TGLA325基因的31．1％。在6．0 LOD分数标准下把所有位点定位在5个连锁群中，从X染色体标记分析连锁图可以看出连锁群包含重复的微卫星位点，因此，这些连锁群可以被相应定位。这张RH图和牛细胞遗传图的标记序列是一致的。因此，牛与人的比较图谱包括5个区段的基因，而且其序列是保守的(虽然其反向在带有长短臂的染色体模式图中不同)，3个区段的颠倒解释了2个X染色体全 部基因顺序的差异。     

日本和牛Y染色体USP9Y基因多态性与父系起源研究

【目的】为了分析日本和牛Y染色体USP9Y基因遗传多态性与父系起源。【方法】利用PCR扩增与限制性酶酶切方法。【结果】对8头日本和牛纯种及19头和秦F1代杂种牛进行Y染色体USP9Y基因多态性及父系起源研究,结果表明:日本和牛与其杂种牛都具有USP9Y基因多态性,USP9Y基因的PCR产物均显示471bp和552bp两种带型,其中552bp带型不能被SspI酶酶切,则这2种带型对应Y1和Y2两种普通牛单倍型组,表明日本和牛含有Y1和Y2两个父系支系,有2个普通牛父系起源。日本和牛和杂种牛单倍型多样度分别为0.5714±0.0945和0.1988±0.1121,提示日本和牛具有较高的父系遗传多样性。【结论】日本和牛具有较高的父系遗传多样性及2个普通牛父系起源。     

应用AML基因进行牛性别鉴定的研究

本文以染色体牙釉蛋白基因(AML)对牛肌肉基因组进行性别鉴定，为应用此基因进行胚胎鉴定提供理论依据。本研究应用奶牛染色体牙釉蛋白基因的DNA序列，设计了牛染色体特异性引物P1和P2，并通过聚合酶链反应(PCR)扩增牛肌肉组织中的X和Y染色体上的牙釉蛋白基因内第五内含子。最后依据其分子量的差异对电泳后的性染色体所呈现的不同区带进行区分，从而达到性别鉴定的目的，具有很高的应用价值。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY（testis—specific protein）是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。     

利用TSPY基因鉴定奶牛早期胚胎性别的研究

TSPY(testis-specific protein)是Y染色体上特异的基因。公牛Y染色体上的TSPY基因的拷贝数达200个。本研究主要探讨利用TPSY基因鉴定胚胎性别的可能性。利用TSPY特异引物,通过PCR技术扩增牛血样DNA的结果为公牛血样均为阳性,母牛为阴性。结果表明,TSPY基因是一个很好的雄性特异标记。PCR扩增TSPY特异序列鉴定牛性别的灵敏度试验表明,DNA的最低需要量为20 pg/μL,提示,TSPY特异基因具有鉴定牛早期胚胎性别的可能。     

Sry基因和Y染色体重复序列在牛早期胚胎性别鉴定中应用效果的比较

本试验以牛Sty基因和Y染色体重复序列作为雄性特异性基因,分别设计引物,建立多重巢式PCR体系,比较二者在牛早期胚胎性别鉴定中的应用效果。试验结果表明,当扩增体系中的模板量为一个胚胎细胞的DNA量时,以Y染色体重复序列构建的扩增体系比Sry基因具有更高的灵敏度和稳定性,更适合用于牛早期胚胎性别鉴定。     

牙釉质基因巢式扩增鉴定牛早期胚胎性别的研究

根据牙釉质基因在牛X染色体和Y染色体上存在的差异设计巢式引物,对牛静脉血基因组DNA样本以及10枚牛早期胚胎DNA样本进行巢式扩增和电泳分析,以鉴定性别。结果表明:利用此方法能够对牛10 pg量血液基因组DNA进行扩增鉴定性别,雌性产生1条片段长度为311 bp的源于X染色体的条带,雄性产生1条源于X染色体的条带(311 bp)和1条片段长度为251 bp的源于Y染色体的条带,对10枚胚胎进行鉴定,6枚为雄性,4枚为雌性。说明牙釉质基因巢式PCR扩增鉴定牛早期胚胎性别方法可靠,准确性和敏感性较高。     

牛结核分枝杆菌特异性核酸探针的克隆与分析

牛结核分枝杆菌是引占结核病的致病源，其染色体ＤＮＡ中含有插入序列ＩＳ１０８１，属于结核杆菌类特异性基因片段，在牛结核杆菌染色体中含有６个拷贝。目前国外普遍有杉该片段作为探针对牛结核病进行鉴定和诊断。本试验采用牛结核分枝杆菌染色体Ｄ避的特民插入片段即ＩＳ１０８１为模闰于ＩＳ１０８１中４３８－４５９和６６４－６８５碱基 的两个片段为引物。利用ＰＣＲ技术扩增出一段２４８ｂｐ的特异性片段，将其克隆进ｐＵ     

牦牛与普通牛、水牛的X染色体基因编码区比较及密码子偏性分析

【目的】从基因组比对及密码子偏性角度分析牦牛与其他牛亚科动物X染色体,有助于了解牦牛品种差异及系统进化地位,为其适应高原低压低氧环境和密码子优化提供参考。【方法】以牦牛X染色体参考基因编码区序列为参考,与普通牛和江河型水牛X染色体参考基因编码区序列进行基因组比对和基因共线性分析,同时进行基因注释,对过滤后的编码区文件进行相对同义密码子使用频率(RSCU)、ENC-plot、PR2-plot和最优密码子确定等偏性分析。【结果】在牦牛X染色体基因编码区发现了参与气管收缩、肺部呼吸及机体代谢等基因与普通牛和水牛存在差异,如KLHL13、CENPI和PGK1等基因;共线性显示长段由强选择压和突变压下表现出的交换线性区域;密码子分析中3种牛亚科动物密码子使用偏性相似,偏性均较弱,均偏向G/C结尾;强偏性密码子(RSCU≥1.5)均为CUG、GUG、AGA、AGG和UGA;牦牛、普通牛和水牛分别筛选出16、13和9个最优密码子,均以A/U结尾。【结论】牦牛与普通牛、水牛相比面临了更大的选择压力,累计的变异程度更大,三者的密码子偏性受到自然选择作用均大于突变作用。研究结果为牦牛的遗传育种、密码子优化...     

牛αS1-酪蛋白基因5'调控区的克隆与分析

编码乳蛋白的基因位于常染色体上,呈共显性遗传.牛酪蛋白基因位于基因组第6号染色体上,编码4种酪蛋白的基因在染色体上的位置依次是αS1-酪蛋白、β-酪蛋白、αS2-酪蛋白和γ-酪蛋白,表明这4种酪蛋白基因的表达受到共同的启动元件和调控元件的调控[1].研究通过数字化差异显示技术分析发现,牛αS1-酪蛋白基因在牛泌乳前后的乳腺组织中的表达量发生着显著的变化,表明αS1-酪蛋白可能与牛的泌乳调控有关.因此,试验克隆了牛αS1-酪蛋白基因5′调控区域,并进行了多种生物信息学分析,现报道如下.     

南阳牛生长性状相关基因组区域全基因组关联分析

本研究旨在筛选和鉴定与南阳牛生长性状相关的基因组区域和候选基因,从而更好地了解牛生长性状的遗传机制。试验共采集71头南阳牛母牛血样并提取基因组DNA,利用SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）技术获得全基因组SNP标记并对试验个体基因型进行分型。对每头个体初生重及不同月龄（6、12、18、24、36）的体重、体高、体斜长、胸围和坐骨端宽及每6个月体增重等生长性状进行全基因组关联分析;获得显著相关的基因组区域后,对其中基因进行功能注释以筛选候选基因。结果显示,共获得141 755个筛选后的SNPs,通过全基因组关联分析鉴定出5个分别与12月龄体重（8号染色体：17 320 634~17 347 720 bp）、12月龄胸围（2号染色体：15 063 190~15 155 309 bp）、24月龄体斜长（11号染色体：60 727 342~81 425 987 bp）、36月龄坐骨端宽（14号染色体：15 635 762~15 643 272 bp）和12~18月龄体增重（26号染色体：40 456 192~40 456 477 bp）等生长性状显著相关的基因组区域（LOD≥6.35）。通过对5个基因组区域内的186个基因进行功能注释,共筛选得到11号染色体上的8个基因（BMP10、IFT172、SDC1、TCF23、TRIM54、RAB1A、VPS54和GDF7）与骨生长、肌肉发育和生长调控有关,建议其可优先作为牛生长性状相关候选基因进行进一步验证。     

中国荷斯坦牛凝血因子XI缺陷症遗传分析

凝血因子XI缺陷症（FactorXIdenciency）是荷斯坦牛的一种常染色体单基因控制的隐性遗传缺陷。该病的遗传基础是由位于牛第27号染色体的凝血因子XI基因外显子12上发生的一段76bp序列插入。本研究采用PCR方法对我国13个主要公牛站的571头荷斯坦公牛的凝血因子XI基因进行了全面检测,未发现隐性有害基因携带者和纯合个体。     

SRY基因和MCM158、MAF45鉴定哺乳动物性别

为了研究SRY基因和Y染色体上微卫星标记对性别鉴定的影响,试验以哺乳动物为研究对象,采用多重PCR技术扩增绵羊和牛基因组中Y染色体上的2个微卫星标记和SRY基因,根据其基因型进行性别鉴定,试图通过一次DNA扩增同时提供性别鉴定和基因分型的信息。结果表明:所设计的SRY基因引物具有高度特异性,是性别鉴定的主要依据;Y染色体上的MCM158、MAF45两标记由于特异性不好而不适用于性别鉴定。     

南阳牛生长性状相关基因组区域全基因组关联分析

本研究旨在筛选和鉴定与南阳牛生长性状相关的基因组区域和候选基因,从而更好地了解牛生长性状的遗传机制。试验共采集71头南阳牛母牛血样并提取基因组DNA,利用SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)技术获得全基因组SNP标记并对试验个体基因型进行分型。对每头个体初生重及不同月龄(6、12、18、24、36)的体重、体高、体斜长、胸围和坐骨端宽及每6个月体增重等生长性状进行全基因组关联分析;获得显著相关的基因组区域后,对其中基因进行功能注释以筛选候选基因。结果显示,共获得141 755个筛选后的SNPs,通过全基因组关联分析鉴定出5个分别与12月龄体重(8号染色体:17 320 634～17 347 720 bp)、12月龄胸围(2号染色体:15 063 190～15 155 309 bp)、24月龄体斜长(11号染色体:60 727 342～81 425 987 bp)、36月龄坐骨端宽(14号染色体:15 635 762～15 643 272 bp)和12～18月龄体增重(26号染色体:40 456 192～40 456 477 bp)等生长性状显著相关的基因组区域(LOD≥6.35)。通过对5个基因组区域内的186个基因进行功能注释,共筛选得到11号染色体上的8个基因(BMP10、IFT172、SDC1、TCF23、TRIM54、RAB1A、VPS54和GDF7)与骨生长、肌肉发育和生长调控有关,建议其可优先作为牛生长性状相关候选基因进行进一步验证。     

西藏牛Y染色体USP9Y基因与mtDNA D-loop区遗传多态性研究

本研究旨在探究西藏牛的Y染色体与mtDNA D-loop区的遗传多态性和起源。采用PCR扩增和限制性内切酶酶切的方法测定30头西藏牛Y染色体USP9Y基因的多态性;采用PCR扩增和测序技术测定30头西藏牛的mtDNAD-loop区序列,利用生物信息学的方法对西藏牛44条D-loop序列(其中14条从Gen Bank下载)进行遗传多态性分析。对30头西藏牛USP9Y基因的PCR产物进行电泳,共检测到471 bp和552 bp 2个片段,且552 bp片段不能被限制性内切酶Ssp I切开,说明西藏牛具有普通牛Y1和Y2 2种单倍型组,其频率分别为0.067和0.933。通过对44条西藏牛mtDNA D-loop全序列进行比对,发现本研究测定的30条西藏牛mtDNA D-loop全序列中,有8条为牦牛序列,说明西藏牛群体中有牦牛的基因渗入。对36条西藏牛mtDNA D-loop全序列进行分析,共检测到62个变异位点,界定了21个mtDNA单倍型,单倍型多样度为0.956 0,核苷酸多样度为0.006 4,表明西藏牛具有丰富的母系遗传多态性。系统发育树显示,西藏牛具有普通牛和瘤牛混合母系起源,且普通牛的单倍型在西藏牛群体中占绝对优势(95.24%)。西藏牛具有丰富的母系遗传多态性,由2个普通牛父系单倍型组构成,应归于普通牛一类,且群体中存在牦牛和瘤牛的基因渗入现象。