嵌合犬瘟热病毒H基因的重组狂犬病病毒的构建及免疫原性研究

【目的】构建表达犬瘟热病毒（CDV）血凝素蛋白H基因的重组狂犬病病毒（RABV）,并研究其生物学特性及免疫原性。【方法】在RABV HEP-dG株基因组G与L基因之间插入CDV H基因,构建重组全长cDNA质粒pHEP-dG （H）。将pHEP-dG （H）与辅助质粒共同转染BHK细胞,拯救携带CDV H基因的重组RABV HEP-dG （H）。将重组病毒接种BHK细胞,分析病毒的扩散能力;将重组病毒接种小鼠,分析病毒的致病性和免疫原性。【结果】RT-PCR及直接免疫荧光显示,传至第3代的病毒仍能检测到H基因,表明CDV H基因已成功插入RABV基因组中,并在HEP-dG （H）中稳定遗传和正确表达。HEP-dG （H）在BHK细胞中的生长曲线与HEP-dG毒株相似,病毒滴度在96 h达到峰值,但HEP-dG （H）的滴度在每个时间点略低于HEP-dG。以感染复数（MOI）为0.005感染BHK细胞,HEP-dG （H）的扩散能力比HEP-dG毒株低。HEP-dG （H）与HEP-dG对6周龄成年小鼠均不致死,但HEP-dG （H）对成年小鼠体重的影响弱于HEP-dG。HEP-dG （H）与HEP-dG均能诱导小鼠产生抗RABV的中和抗体,免疫后7 d抗体已达到保护水平（0.5 EU/mL）;此外,HEP-dG （H）可诱导产生CDV中和抗体。HEP-dG （H）与HEP-dG免疫小鼠3周后,均能抵御RABV标准攻毒毒株CVS-24的攻击。【结论】本研究成功构建重组RABV HEP-dG （H）,其具有良好的免疫原性和安全性,可作为RABV-CDV新型二联基因工程候选疫苗。     

紫外线抵抗相关基因UVRAG影响狂犬病病毒感染机制的研究

为研究宿主因子紫外线抵抗相关基因(UVRAG)影响狂犬病病毒(RABV)感染的机制,本研究在HEK293细胞中干扰或过表达UVRAG后感染表达mCherry蛋白的重组RABV(rERA-mCherry),于感染后不同时间(24 h、48 h、72 h、96 h)检测上清中病毒的滴度并绘制病毒的生长曲线。结果显示,与转染对照siControl的细胞相比,干扰UVRAG的表达再感染RABV后不同时间细胞上清中的病毒滴度均显著降低(p0.01),表明干扰UVRAG的表达后抑制RABV的复制能力;而过表达UVRAG后则不影响RABV的增殖能力。干扰293细胞中UVRAG的表达后分别感染表达RABV G蛋白的重组VSV(rERA-G-VSV)及VSV,6 h后利用q PCR方法检测各细胞中的病毒拷贝数。结果显示,与未干扰的细胞相比,干扰UVRAG表达后细胞中rERA-G-VSV基因拷贝数极显著下降(p0.001);但干扰或者未干扰细胞中VSV基因拷贝数则无显著差别。表明RABV G蛋白是rERA-G-VSV在干扰UVRAG表达细胞中增殖下降的原因且UVRAG影响RABV感染的早期侵入阶段。干扰293细胞中UVRAG表达后感染rERAmCherry,利用酸绕过试验进一步分析RABV感染的阶段;上述干扰细胞感染rERA-mCherry后不同时间点(0、1.5 h、6 h)利用qPCR方法检测病毒基因拷贝数,分析UVRAG影响RABV侵入的具体阶段。酸绕过试验结果显示,经pH7.5的PBS处理后,干扰组的细胞相对于未干扰组细胞中RABV基因拷贝数极显著下降(p0.001);但pH5.5的酸性PBS处理后两组转染细胞中的病毒拷贝数无显著差异。进一步证明UVRAG在RABV感染早期的侵入阶段发挥重要作用。不同时间点病毒基因拷贝数的qPCR检测结果显示,病毒感染后0、1.5 h两种转染细胞中的病毒拷贝数均无显著差异,但在感染病毒6 h时干扰组的细胞相比于未干扰组的细胞中病毒的拷贝数显著降低(p0.01)。表明UVRAG影响病毒的胞内运输阶段。利用免疫共沉淀试验(Co-IP)检测UVRAG及其不同结构域蛋白与RABV受体一代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)的相互作用关系,结果显示UVRAG的N端aa1～aa147与mGluR2存在特异性的相互作用。以上结果表明,UVRAG影响RABV的胞内运输可能与其和mGluR2的互作相关。本研究初步揭示了UVRAG在RABV感染中的作用,为RABV侵入机制的揭示奠定了基础。     

香豆素化合物体内外抗狂犬病病毒的效果

狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的一种以侵害中枢神经系统为特征的高度致死性人兽共患传染病,虽然人类尝试了多种方法用于治疗狂犬病,但到目前为止,狂犬病一旦出现临床症状,死亡率仍高达100%,因此,寻找有效的抗RABV药物仍是亟待解决的问题。已有研究显示香豆素化合物(coumarin,CM)具有一定的抗病毒作用,但其对RABV的作用目前尚没有研究。首先以BHK-21细胞为模型,通过SRB、直接免疫荧光(DFA)和病毒滴度等方法,在体外筛选具有良好抗RABV作用的CM,进而从直接灭活、阻滞吸附、不同时间点对病毒抑制效果等方面探讨CM体外抗RABV的作用机制。随后构建RABV感染动物模型,观察筛选获得的CM是否可以挽救病毒感染小鼠。结果显示,CM-3(9种CM分别标记为CM-1～9)可以有效抑制RABV在宿主细胞内的复制,但不能直接灭活病毒,也不能阻滞RABV对宿主细胞的吸附;其在RABV感染48h内均可以显著抑制病毒复制,最高抑制率可达60.0%。另外,结果显示在RABV感染后3～12h内用药,CM-3的抑制效果更为显著,抑制率均为50.0%以上;随后,通过体内试验证实CM-3(50mg/kg)可将感染小鼠的存活率由0%提高至12.5%。综上,结果提示,CM-3可能通过感染后抑制病毒复制的方式发挥抗RABV的作用,而此类结构的CM有可能作为潜在的药物用于狂犬病的治疗。     

狂犬病病毒入胞途径的初步探索

狂犬病病毒(rabies virus,RABV)具有高度嗜神经性,通过识别细胞膜上特异性受体并借助内吞途径侵入细胞。为了探究其入胞途径,本研究在人神经瘤细胞(SH-SY5Y)和非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)上,应用氯丙嗪(chlorpromazine)、制霉菌素(nystatin)、巴弗洛霉素a1(bafilomycin a1)、dynasore等抑制剂处理细胞后,进行RABV感染,通过检测病毒N基因拷贝数和RABV效价,对RABV入胞途径进行初步探究。结果显示,RABV通过网格蛋白介导、低pH值和发动蛋白(dynamin)依赖途径侵入SH-SY5Y和Vero细胞,但不通过小窝蛋白依赖途径入胞。这些结果为进一步研究狂犬病病毒感染机制和药物靶点研究提供了新的数据。     

猪圆环病毒2型ORF-2全基因重组腺病毒的构建与鉴定

扩增猪圆环病毒2型的ORF-2全基因(702 bp),将目的片段与缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMV K-NpA连接,构建重组穿梭质粒CMV-ORF-2。将穿梭质粒与骨架质粒pacAd5 9.2-100经限制性内切酶PacI线性化后共转染293T细胞,进行细胞内重组。7~15 d后获重组腺病毒rAd5 CMV-OPFF-2与对照组重组腺病毒rAd5 CMV-GFP。使用293细胞进行病毒增殖,对增殖稳定的rAd5 CMV-ORF-2进行鉴定;rAd5 CMV-OPFF-2 TCID_(50),为10~(7.5/)50μL,用该代次rAd5 CMV-ORF-2进行PCV-2阳性血清中和试验,结果表明,重组腺病毒成功,PCV-2阳性血清不能中和重组腺病毒。     

AP2M1在狂犬病病毒侵入中的作用研究

本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析AP2M1对RABV感染率的影响。结果显示:敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验显示AP2M1在RABV感染过程中发挥作用。激光共聚焦观察显示RABV G蛋白与AP2M1无共定位。免疫共沉淀实验显示AP2M1与RABV G蛋白无直接相互作用。本研究结果表明,AP2M1基因在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。     

O型口蹄疫多基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

根据GenBank公布的序列设计1对引物扩增O型口蹄疫病毒P12A3C基因并亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV内.含有目的基因的穿梭质粒(pShuttle-PAC)线性化后和腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化入大肠杆菌BJ5183感受态细菌.利用细菌内同源重组法得到重组腺病毒质粒(pAd-PAC).在Lipofectamine2000介导下重组腺病毒质粒转染HEK293细胞得到重组腺病毒(Ad-PAC).半数组织培养感染剂量(TCID_(50))测定、免疫荧光试验(IFA)和连续传代后目的基因的PCR扩增,证实重组病毒滴度为10~(5.5) TCID_(50)/0.1 mL,重组病毒HEK293细胞中得以表达且遗传稳定性良好;动物试验表明,该重组病毒能够诱导小鼠产生较高水平的针对口蹄疫病毒的特异性抗体;本试验为口蹄疫重组腺病毒活载体疫苗的进一步研究和应用奠定了基础.     

红色荧光示踪狂犬病病毒ERA株病毒粒子方法的建立

为建立一种狂犬病病毒(RABV)荧光标记方法,便于有效地观察研究RABV侵入细胞及脱壳的过程,本研究采用CY5-NHS酯红色荧光染料标记氨基的方法将纯化的RABV ERA株进行CY5-NHS酯荧光染料标记;采用亲脂性羰花青荧光染料将细胞膜染成绿色;采用DNA荧光染料将细胞核染成亮蓝色;在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下成像,动态观察病毒吸附细胞并内吞的过程。与传统的染色方法相比,本研究建立的病毒标记方法更适合在3D活细胞激光共聚焦分析成像系统下观察和拍摄RABV感染细胞的过程,为RABV感染机制的研究提供了一种有效研究方法,对于其它弹状病毒科病毒标记方法的建立也具有一定的参考意义。     

表达狂犬病病毒G蛋白重组犬瘟热病毒Snyder Hill株的构建及鉴定

为构建一株表达狂犬病病毒(RV) G蛋白的重组犬瘟热病毒(CDV),本研究以本实验室分离的CDVSnyder Hill疫苗株为基础,在CDV P和M基因之间插入RV弱毒疫苗株ERA G蛋白基因,构建重组质粒p CI-CDV-RVG及表达CDV N、P和L蛋白的辅助质粒p CI-CDVN、p CI-CDVP和p CI-CDVL,将重组质粒和辅助质粒共转染BSR细胞,拯救获得了表达RV G蛋白的重组犬瘟热病毒(rCDV-RVG),将该重组病毒在Vero细胞中传代,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定。结果显示RV G基因能够在r CDV-RVG中稳定存在并正确表达。病毒生长动力学曲线显示,重组病毒在Vero细胞中的增殖效率与拯救的亲本病毒r CDV无显著差异(p0.05)。本研究表明CDV Snyder Hill株作为载体表达外源基因的潜力,为研制高效、安全、廉价的CDV-RV二联活载体疫苗奠定基础。     

狂犬病病毒CVS-11株间隔区缩短的缺失株构建及特性研究

为了探究狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)基因间隔区对狂犬病病毒生物学特性的影响,试验以狂犬病病毒CVS-11株为母本株,将其基因间隔区碱基均替换为胞嘧啶和胸腺嘧啶,分段扩增后与真核表达载体进行同源重组,运用反向遗传技术进行重组病毒拯救,经过菌液PCR鉴定和直接免疫荧光检测获得重组病毒rCVS11-2222。结果表明:重组病毒基因组稳定,重组病毒rCVS11-2222在细胞中的复制表现出与CVS-11株相似的特点;小鼠存活率显著降低。说明狂犬病病毒CVS-11株基因间隔区的缩短增强了原毒株的致病力。     

Hsp90AB1在狂犬病病毒复制过程中的功能初探

为了探究宿主蛋白Hsp90AB1在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)复制过程中的功能,以RABV疫苗毒株HEP-Flury感染鼠神经瘤母细胞N2a为模型,分析Hsp90AB1对RABV复制的影响。采用RNA干扰的方式,发现Hsp90AB1基因敲降后可影响病毒基因的转录及其表达,而未影响病毒的反基因组水平以及病毒感染力,表明Hsp90AB1在转录或蛋白表达水平上影响RABV的复制。由此初步发现Hsp90AB1在RABV复制过程中的作用方式,为继续深入研究Hsp90AB1在RABV感染过程中的作用机制提供了基础数据。     

Rab5与Rab7调控N2a细胞内狂犬病病毒的早期感染

狂犬病病毒(rabies virus,RABV)作为一种高度嗜神经性的病毒,通过网格蛋白介导和pH依赖的内吞途径侵入神经细胞,然后经胞内体途径进行传输。已有研究表明,Rab5和Rab7是介导胞内体分选、成熟及定向运输的关键蛋白,而RABV胞内运输是否也受到这两者的调控尚不清楚。本试验通过免疫荧光、Western blot及TCID50等技术,检测了N2a中RABV核蛋白(N)和Rab5与Rab7的胞内共定位及RNAi下调Rab5与Rab7表达时,N蛋白表达水平、病毒滴度等的变化。结果发现,Rab5和Rab7与RABV N蛋白存在共定位;当Rab5和Rab7表达下调,RABV感染初期N蛋白表达显著下降,且病毒TCID50也随之降低。结果表明,RABV感染受Rab5和Rab7调节。为进一步解析狂犬病病毒逆轴浆传输机制提供了新的数据。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。     

表达gpt和EGFP基因重组山羊痘病毒的构建和鉴定

在包含山羊痘病毒(Goatpox virus,GPV)疫苗株复制非必需区TK(Thymidine kinase)基因和背靠背启动子的质粒PtkPP的两个启动子下游插入EGFP(增强绿色荧光蛋白)基因,构建了质粒PtkPegfpP和PtkPPegfp,这两个重组质粒分别瞬时转染LT细胞,验证了启动子P11和P7.5能成功表达EGFP基因后,在PtkPP启动子P11的下游插入gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶)基因和EGFP基因,构建重组质粒PtkPgpt-egfpP,该重组质粒和GPV同源重组获得重组病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP,利用MPA(霉芬酸)阻断核酸代谢途径筛选到稳定表达EGFP基因的重组GPV。为进一步开展GPV活载体疫苗的研究提供了技术平台。     

表达H5N1亚型禽流感HA-NA基因重组火鸡疱疹病毒的构建

将禽流感病毒H5N1亚型具有免疫原性的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因,克隆于表达质粒Tmd-CMV-IRES-EGFP中,使其位于含细胞巨化病毒(CMV)早期启动子的调控下,并与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)串联,将上述串联基因插入到火鸡疱疹病毒(HVT)基因的非必需区(US10)中,从而构建了带标记的重组转移质粒。将该转移载体质粒感染HVT的鸡胚成纤维细胞(CEF),利用脂质体共同转染CEF,待病毒蚀斑出现后,利用蚀斑筛选带有绿色荧光的重组病毒蚀斑,数轮蚀斑纯化,经荧光和PCR初步鉴定获得了重组火鸡疱疹病毒。     

猪线粒体抗病毒信号蛋白MAVS对口蹄疫病毒感染宿主的影响

采用构建猪源MAVS重组质粒pEGFP-MAVS,将其转染PK-15细胞24h后,再感染口蹄疫病毒(MOI=0.1),通过Western blot和real-time PCR检测MAVS融合蛋白表达及对口蹄疫病毒感染宿主细胞的复制和病毒感染滴度。结果显示:重组质粒pEGFP-MAVS能在PK-15细胞中获得表达,并且上调MAVS基因对口蹄疫病毒在宿主细胞中的早期复制有显著抑制作用,病毒的感染滴度也有一定的降低。结果表明:MAVS具有一定的抗病毒作用,此为进一步研究口蹄疫病毒逃逸宿主天然免疫的机制奠定了基础。     

马尔堡病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的以原核表达的方式获得了马尔堡病毒的核蛋白,并纯化。方法将马尔堡病毒核蛋白基因亚克隆到原核表达质粒pET-28(a)中,构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,并将重组质粒用热休克方法转化BL21(DE3)感受态细菌,用IPTG诱导蛋白表达后,以SDS-PAGE分析表达形式及表达量,并利用His-Band Ni+柱纯化。结果成功构建重组表达质粒pET-28(a)-M-NP,以1.0mmol/L终浓度的IPTG在37℃诱导表达5h后,破菌沉淀中有目的蛋白表达。结论成功表达并纯化了马尔堡病毒的核蛋白,为后续研究奠定了基础。     

表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp~1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失突变株的构建及纯化

根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。