玉米自交系SSR技术反应体系的优化

以玉米自交系为材料,研究了PCR反应体系的Mg(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、模板DNA浓度及退火温度对玉米自交系SSR扩增结果的影响,确定适合玉米自交系SSR分子标记研究的优化体系.最终确定总反应体系为20μmol/L,Mg(2+)浓度3.0mmol/L、dNTPs 0.1mmol/L、引物0.45μmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 50ng.PCR扩增条件:94℃预变性5 min;94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 1 min,35个循环;最后72℃5 min.     

小桐子SSR-PCR反应体系的优化

采用改良的CTAB法从小桐子嫩叶中提取基因组DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和SSR-PCR扩增检测,结果表明,改良CTAB法提取的小桐子基因组DNA完整性好,纯度较高,可作为SSR分子标记的模板。同时,对影响小桐子SSR-PCR扩增的d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物及Mg2+浓度等4个因素进行了优化,优化后的小桐子SSR-PCR扩增的最佳反应体系为:在20μL的反应体系中含有模板DNA 100 ng,d NTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶100 U·m L~(-1),引物0.6μmol·L~(-1),Mg~(2+)1.5 mmol·L~(-1)。适宜的扩增程序为:94℃预变性3 min;94℃变性1 min,51~53℃(退火温度随引物不同而改变)退火1 min,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸10 min。     

番茄微卫星标记(SSR)反应体系的优化研究

利用番茄材料研究了番茄SSR技术中PCR体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:番茄SSR的反应程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,50℃复性30s,68℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸8min为佳。反应体系中,模板DNA的适宜浓度为20～40ng,适宜的引物浓度为0.4μmol·L-1,dNTP的适宜浓度为200μmol·L-1,Mg2+的最适浓度范围为2.0mmol·L-1,Taq聚合酶在15μL反应体系中宜加入0.65U。PCR产物检测时聚丙烯酰胺凝胶的分辨率显著高于琼脂糖电泳。     

玉米品种真实性鉴定中SSR技术体系的优化

[目的]优化玉米品种真实性鉴定中的SSR技术体系。[方法]以11份玉米骨干自交系为材料,通过对影响SSR扩增质量的Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶的浓度等因素进行优化和比较,建立了适于玉米品种真实性鉴定的SSR标记技术体系,并以5个玉米杂交种为例,验证该体系在玉米杂交种真实性鉴定中的可行性。[结果]Mg2+浓度为2.5 mmol/L时,扩增效果最佳。dNTPs浓度为0.3 mmol/L时,扩增效果最好。引物浓度为0.2μmol/L较为适宜。TaqDNA聚合酶浓度为1.0 U时,扩增效果较好。优化后的PCR反应体系为:1×PCR缓冲液,2.5 mmol/LMg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.2μmol/L正、反向引物,1.0 UTaqDNA聚合酶,40 ng样品DNA,总体积25μl。[结论]该研究优化的SSR技术体系可以有效地对玉米杂交种进行真实性鉴定。     

水稻PCR反应体系的正交设计优化及验证(英文)

[目的]筛选经济、稳定性好的水稻PCR反应体系,并检测所选体系在不同的基于PCR反应的分子标记中的通用性。[方法]以CTAB法提取的水稻叶片DNA为模板,应用L16(45)正交设计进行PCR反应体系优化。选用20μl体系的浓度梯度设计,对DNA模板浓度、dNTP、引物浓度、Taq酶、Mg2+浓度5个因素设计4个水平。先以1个SSR标记(MRG6102)对16个不同体系进行筛选。为了验证所选最优体系的稳定性,再选用6个SSR标记(RM213、RM207、RM208、RM155、OSM89、OSM91)对20个水稻品种(系)进行扩增;为检测除SSR标记以外的基于PCR反应标记的通用性,选用2个STS标记(OSR20、OSR32)及2个显性标记(Pibdom,Lys145)进行检测。[结果]16个不同处理组合均扩增出了清晰谱带,但扩增效果及PCR产量有差异。最经济、适用的体系为:20μl反应体系,20ng模板DNA,浓度150μmol/LdNTP,浓度0.2μmol/L引物,1.0UTaqDNA聚合酶,浓度1.5mmol/LMg2+,1×Taqbuffer,剩余体积用超纯水补齐。PCR扩增程序为:95℃预变性3min;94℃变性45s,48～55℃退火45s(不同的引物其最佳退火温度不同),72℃延伸1min(对于其他一些基于PCR反应的标记,如果预期片段较大,可以适当调整延伸时间到1.5min),共36个循环;72℃延伸7min;然后4℃保存。[结论]该研究确定了水稻PCR优化反应体系,该体系也适用于一些其他基于PCR反应的标记。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg^2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2 min;94℃变性30 s,48℃复性30 s,72℃延伸1 min,共40次循环;72℃延伸7 min。最佳反应体系为：DNA模板30 ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTPs浓度0.3 mmol/L,Mg^2＋2.5 mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立（摘要）

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,共40次循环;72℃延伸7min。最佳反应体系为：DNA模板30ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg^2＋2.5mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化（英文）

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA。从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-trnH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析。电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%NaOH)变性15min,采用6%的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3~4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCRSSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

大蒜SSR体系的建立与优化

为建立适宜大蒜(Allium sativum L.)的SSR反应体系和扩增程序,应用L16(45)正交设计对影响SSR-PCR的主要参数进行优化。结果表明,适宜大蒜的SSR反应体系总体积为20μL,其中含TaqDNA聚合酶0.02 U/μL、引物为0.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、DNA 30 mg/L;PCR适宜扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃45 s,72℃延伸90 s,35次循环,94℃变性30 s,53℃45 s,72℃延伸1 min,10次循环的最后一个循环延伸增加为10 min。并优化引物最适合退火温度为53.5~58.5℃。利用此反应体系对40份大蒜品种进行SSR扩增并电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,证明此体系稳定可靠。在此基础上,利用优化的SSR反应体系对100对大葱SSR引物进行筛选,从中筛选出1对扩增谱带清晰稳定性好的SSR引物,并对40份大蒜品种进行遗传多样性分析。这一对SSR引物共检测出3个多态性条带可将供试材料聚为2大类,大部分品种(系)都按照其地理来源和遗传背景进行聚类。     

萱草ISSR-PCR最佳反应体系的建立

[目的]为利用ISSR标记研究萱草的遗传多样性和和辅助育种奠定基础。[方法]从萱草中提取基因组DNA,建立萱草的ISSR-PCR反应体系,并通过正交试验对其进行优化。[结果]萱草的最佳ISSR-PCR反应体系为:ddH2O16.8μl、2.5 mmol/LdNTP2.0μl、10×buffer 2.5μl、10μmol/LPrimer0.3μl、50 ng/LDNA3μl、Taq酶1 U,总体积25μl。萱草的最佳ISSR扩增反应程序为:94℃变性5 min,94℃变性45 s、48.3℃退火1 min、72℃延伸2 min,共38个循环,最后72℃延伸7 min。该反应程序下进行的ISSR扩增,扩增产物最多,银染的效果最好。[结论]该研究建立了萱草ISSR-PCR的最佳反应体系和反应程序,通过ISSR扩增可获得清晰、稳定的条带。     

吉林省主推中晚熟期玉米品种遗传多样性分析（摘要）

[目的]应用SSR分子标记研究吉林省主推中晚熟期玉米品种的遗传多样性。[方法]通过10对引物对供试材料进行扩增,并用聚丙烯凝胶电泳进行检测。[结果]10对SSR引物在供试材料中共检测出110个等位基因变异,每对SSR引物检测出的等位基因数为4～17个,平均每个位点11个,每个SSR位点的PIC变化范围在0.63～0.93之间,平均0.842。43个玉米杂交种之间的遗传相似系数变化范围为0.664～0.918,平均为0.774,其中样本间遗传相似系数在0.85以上的共有30个。结合聚类分析和各品种的谱系来源,结果表明43份吉林省主推中晚熟期玉米品种的遗传相似性相对较大。[结论]吉林省中晚熟期种质资源相对狭窄,有待于进一步引种创新。     

木豆随机扩增多态性DNA的反应体系研究

[目的]分析影响木豆RAPD-PCR反应中的主要因素,优化反应条件。[方法]以木豆品种ICPL87091为试材,以木豆基因组DNA为模板,通过对PCR反应体系中各种参数的优化设置,分析比较各种因素对RAPD扩增结果的影响,建立适宜的反应体系。[结果]试验得到了较为理想的适宜木豆的反应体系。优化的木豆RAPD反应条件为:模板DNA浓度30 ng,随机引物1.6μmol/L,dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)各0.2 mmol/L,Mg2+浓度2.0 mmol/L,Taq酶1.0 U,反应体积为25μl。循环体系为:先94℃1 min,35℃2 min,72℃2 min,5个循环;然后94℃30 s,37℃1 min,72℃1 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。[结论]利用这一反应体系可有效地进行木豆随机扩增多态性DNA分析,极大地提高了实验结果的可重复性。     

白木香基因组DNA的提取及ISSR反应条件的优化

[目的]以白木香为试验材料,研究基因组DNA提取方法,并优化ISSR-PCR反应体系。[方法]利用快速提取仪和微量液氮法提取DNA,并对ISSR-PCR反应体系进行单因素筛选。[结果]微量液氮法提取的DNA质量好于快速提取仪,但2种方法得到的DNA对后续ISSR研究没有明显的差异。同时,建立了最适的白木香ISSR-PCR体系,即25lμPCR反应体积中,1×PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,4ng/μl模板DNA,200μmol/L dNTPs,1.1 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环,94℃变性45 s,复性温度根据各引物的TM值略低1~2℃,45 s,72℃延伸75 s,循环结束后72℃延伸7 min。[结论]优化系统的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行白木香遗传多样性研究提供了基础。     

亚麻RAPD-PCR体系的优化及引物的筛选

[目的]优化亚麻RAPD反应条件,筛选亚麻RAPD引物。[方法]DNA条带扩增采用PCR技术,条带的分离采用琼脂糖凝胶电泳法,成像利用紫外成像系统。[结果]试验优化亚麻RAPD反应条件：25出反应体系中,含10×Buffer,Mg^2＋ （1mmol／L）,Taq酶1U,Genome DNA 50ng．dNTP 0．25mmol／L．RAPD primer1．5μmol／L。PER反应程序为：94℃预变性4min;97℃变性40s,37℃退火1min,72℃延伸90s,40个循环;72℃延伸10min。试验利用3个有代表性的亚麻品种从70条引物中筛选出12条多态性好,重复性高的引物。[结论]该试验筛选出12条引物,并优化了亚麻RAPD反应条件,为亚麻的分子鉴定奠定了基础。     

茶薪菇基因组DNA的RAPD反应体系优化

[目的]旨在筛选出茶薪菇RAPD反应体系的最佳条件。[方法]采用单因素试验,对RAPD反应体系所需的Mg2+浓度、模板DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及退火温度进行初步筛选。[结果]茶薪菇RAPD扩增的最佳反应体系为:2.5μl Buffer,2.0mmol/L Mg2+,75 ng DNA,0.5μmol/LPrimer,150μmol/LdNTPs,2.0 UTaq酶。反应程序为:92℃预变性5 min,(92℃1 min,35.5℃1 min,72℃延伸2 min)35个循环,72℃10 min。[结论]为茶薪菇RAPD分析及其亲缘关系、遗传多样性研究提供了参考依据。     

油茶DNA提取及RAPD分析最佳反应体系的建立

[目的]为建立油茶RAPD分析的最佳反应体系。[方法]分别用改良SDS法和CTAB法从12个油茶品种的新鲜幼叶中提取基因组DNA。通过测定OD260和OD280来比较两种方法提取DNA的纯度。建立油茶的RAPD反应程序,通过优化反应条件获得油茶RAPD分析的最佳反应体系。[结果]CTAB法提取的油茶基因组DNA纯度高于SDS法。油茶RAPD分析的最佳反应体系为:1.0 UTaq DNA聚合酶、1.5 mmol/L MgCl22、00μmol/L dNTP1、0 pmol/L随机引物2、0 ng DNA模板2、μl 10×PCR buffer,加重蒸水至20μl。油茶的RAPD反应程序为:95℃预变性3 min;94℃变性1 min,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,40循环;72℃延伸7 min。[结论]该研究所用DNA纯度较高,反应条件控制严格,试验中扩增稳定性较好,是适合油茶RAPD分析的最佳反应体系。     

西瓜SRAP-PCR程序和体系优化

建立适宜西瓜DNA的SRAP-PCR扩增体系,为西瓜基因图谱的构建和分子标记打下基础。以西瓜中华拳王品种为试验材料,探索了西瓜SRAP-PCR反应程序,并对西瓜SRAP-PCR反应体系的各影响因子进行梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应程序和体系。最佳SRAP-PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。最佳SRAP-PCR反应体系(15μl)为:DNA 100 ng,dNTPs 0.3 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,primer 7.5 pmol/L,Taq polymerase 0.75 U。该程序和体系能很好地满足西瓜基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于西瓜遗传研究是可行的。