葡萄VvERF655基因响应可可毛色二孢的表达模式及VvERF655与VvWRKY75的互作

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae引起的葡萄溃疡病是葡萄上的主要枝干病害之一, 对葡萄生产造成巨大影响。课题组前期研究发现葡萄VvWRKY75负调控葡萄溃疡病的发生, 共表达网络分析表明, VvERF655基因与VvWRKY75共表达。为明确VvERF655是否参与葡萄对葡萄溃疡病的调控过程, 本研究克隆了VvERF655, 运用生物信息学对VvERF655的理化性质等进行分析, 并通过RT-qPCR对VvERF655基因的表达模式进行分析, 结果表明, VvERF655响应L. theobromae侵染并明显受脱落酸、水杨酸激素诱导。通过酵母双杂交技术分析发现, VvWRKY75与VvERF655在酵母中存在互作关系。以上结果表明, VvERF655可能参与寄主对可可毛色二孢的侵染以及激素调控过程。本研究为进一步揭示葡萄VvERF655基因的生物学功能奠定基础。     

葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

防治葡萄溃疡病的杀菌剂筛选与评价

采用菌丝生长速率法和孢子萌发法测定了7种杀菌剂对可可毛色二孢CSS-01s的室内生物活性,筛选出3种抑制效果较好的杀菌剂;通过对离体葡萄绿枝条及盆栽葡萄幼苗新梢进行人工接种病原菌,进一步评价杀菌剂的防治效果。结果表明,7种杀菌剂对可可毛色二孢菌丝生长和孢子萌发表现出不同的抑制活性,其中戊唑醇、氯氟醚菌唑、啶酰菌胺和氟啶胺对菌丝生长的抑制作用较强,EC₅₀分别为0.116、0.137、0.109μg/mL和0.119μg/mL;戊唑醇、氯氟醚菌唑、氟啶胺对孢子萌发的抑制作用较强,EC₅₀分别为0.420、0.595μg/mL和1.885μg/mL。CSS-01s接种离体葡萄绿枝条试验中,戊唑醇100、200 mg/L,氯氟醚菌唑100、300 mg/L和氟啶胺100、200 mg/L的防治效果无显著差异,在57.81%～65.31%;CSS-01s接种葡萄幼苗新梢试验中,氟啶胺200 mg/L的防治效果最好,为77.56%,与氟啶胺100 mg/L、氯氟醚菌唑100、300 mg/L和戊唑醇200 mg/L之间无显著差异,但显著高于戊唑醇100...     

可可毛色二孢效应子LT_397基因的克隆及转录分析

可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae是引起葡萄溃疡病的主要致病菌之一。病原菌会分泌许多效应子抑制植物的防御反应。本试验对可可毛色二孢特有的效应子LT_397基因进行克隆,开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1140 bp,含有11个半胱氨酸。生物信息学软件预测显示:效应子LT_397信号肽为位于N端的1~16个氨基酸。qRT-PCR结果表明:LT_397受可可毛色二孢诱导下,在侵染24 h的基因相对转录水平最高;在逆境胁迫处理方面:LT_397在营养、氧化、离子、酸碱和UV胁迫下基因的相对转录水平都上升。烟草瞬时表达表明,效应子LT_397可抑制水稻细菌性谷枯病菌Burkholderia glumae引发的过敏反应(hypersensitive response,HR)。以上结果为进一步分析效应子对寄主的致病机制奠定了基础。     

葡萄乙醛脱氢酶VvALDH10A9基因的克隆、表达及酶活性分析

由葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae真菌引起的葡萄溃疡病Botryosphaeria dieback是葡萄上的主要枝干病害,严重影响葡萄产量和品质。鉴定和分析参与葡萄与葡萄溃疡病菌互作的基因,有助于揭示和阐明葡萄抗溃疡病的信号通路。本研究根据葡萄溃疡病菌侵染后的葡萄转录组数据信息,利用逆转录聚合酶链式反应技术(RTPCR)克隆了一个受葡萄溃疡病菌诱导上调表达的乙醛脱氢酶基因VvALDH10A9(Vitis vinifera aldehyde dehydrogenase 10A9)。系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与拟南芥AtALDH10A8亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析VvALDH10A9的表达结果表明:VvALDH10A9的表达具有组织特异性,在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低;葡萄溃疡病菌侵染后,VvALDH10A9在葡萄抗病品种中表达变化不明显,而在葡萄感病品种中该基因显著上调表达。利用原核蛋白表达系统诱导合成的VvALDH10A9蛋白,经纯化后可降解乙醛,表明VvALDH10A9蛋白具有乙醛脱氢酶活性。     

毛葡萄穗轴褐腐病病原菌鉴定及其生物学特性

罗城仫佬族自治县是广西毛葡萄主产区。穗轴褐腐病是近年为害毛葡萄花穗穗轴的主要病害。作者根据病原菌形态、致病性,并利用分子鉴定方法,将该病的致病菌鉴定为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。该病菌生长最适温度为28~30℃;可生长pH值为3~11.5,其中,pH 3~4利于病原菌产生分生孢子;能有效利用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等14种供试碳源,但以葡萄糖最好;能利用DL-丙氨酸、硝酸钠、DL-甲硫氨酸等10种供试氮源,但以DL-丙氨酸最适。     

荻草谷网蚜ABCG1基因的克隆及表达模式分析

荻草谷网蚜Sitobion miscanthi是严重威胁我国小麦生产安全的迁飞性害虫。蜕皮激素是参与蚜虫翅型分化调控的内激素, 在有翅成蚜体内保持高滴度, 且诱导后代产生更高比例的无翅蚜, 其进出靶细胞需要经过细胞膜上特定蛋白的转运。ATP结合盒转运蛋白家族G亚家族(ATP-binding cassette transporter G, ABCG)中的 ABCG1是通过跨膜转运昆虫类固醇、对蜕皮激素信号进行负调控的功能蛋白之一, 在蚜虫中尚未见报道。本文克隆了荻草谷网蚜ABCG1(SmisABCG1)基因, 并进行了序列比对、系统进化分析以及不同组织部位和发育时期表达模式分析。结果显示, SmisABCG1基因的开放阅读框全长为1 851 bp, 编码616个氨基酸, 含7个跨膜结构域, 符合ABCG蛋白家族典型结构特性, 基因登录ID:OP626323。昆虫间ABCG1较保守, 该蛋白系统进化关系与各自物种间亲缘关系的远近保持一致。其中, SmisABCG1与来自豌豆蚜、禾谷缢管蚜、棉蚜、花生蚜和雪松长足大蚜等的ABCG1氨基酸序列高度一致(>87%), 以上蚜虫聚为一支。与SmisABCG1亲缘关系最近的是豌豆蚜的ABCG1, 其次是半翅目的褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱, 与膜翅目的新疆菜叶蜂、阿里山潜蝇茧蜂以及鞘翅目的赤拟谷盗、蜂箱小甲虫亲缘关系较远。该基因在伪胚胎和成蚜阶段高表达。包含伪胚胎的有翅、无翅成蚜整蚜SmisABCG1的转录水平无显著差异, 但其在来自有翅成蚜的伪胚胎中的转录水平高于无翅成蚜伪胚胎, 证实无翅成蚜自身的转录水平较高, 而有翅成蚜较低。进一步分析显示这一差异主要是无翅蚜胸部显著高表达所导致。基于该蛋白对蜕皮激素负调控, 与有翅成蚜转录水平低, 但蜕皮激素水平更高相符合。     

甘薯爪哇黑腐病的病原鉴定

甘薯爪哇黑腐病是甘薯贮藏期的一种真菌性病害,是全球热带和亚热带地区甘薯贮藏期的重要病害之一。2013年我们从广东湛江采集的甘薯中,发现病薯薯块由两端向中间变黑变硬,切开发病薯块,在伤口处会逐渐长出黑色或灰色的菌丝。发病薯块室内放置30d后表面龟裂,裂口处有大量的黑色粉末溢出,显微镜下观察发现大量褐色有隔膜孢子。经对病原菌进行分离,采用柯赫氏法则回接验证,依据病原菌的形态特征和rDNA-ITS及β-tubulin基因序列,确定该病害为甘薯爪哇黑腐病,病原菌为可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。致病性测定发现该病具有较强致病性,对于贮藏期甘薯具有较大威胁。这是国内首次对该病进行的报道。     

棉铃虫 JNKs 基因的克隆及表达分析

c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)是MAPK家族(mitogen-activated protein kinases, 丝裂原活化蛋白激酶)的重要成员, 具有参与昆虫抗逆反应等多种功能。为明确JNK在棉铃虫 Helicoverpa armigera 中的表达特性及其对Bt杀虫蛋白的应激与免疫反应, 本研究通过PCR克隆得到2个棉铃虫 JNK 基因 HaJNK1 和 HaJNK2; 生物信息学分析结果显示: HaJNK1和 HaJNK2基因开放阅读框分别为1 191、1 143 bp, 分别编码397、381个氨基酸。系统进化树分析结果表明棉铃虫 HaJNK1 与黏虫 Mythimna separata 聚为一支, 亲缘关系较近, HaJNK2与 家蚕 Bombyx mori 聚为一支, 同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术分析 HaJNK1 与 HaJNK2 在棉铃虫不同发育时期、不同组织中的表达量, 发现 HaJNK1 与 HaJNK2 在卵中表达量最高, 其次是雌成虫; HaJNK1 在性腺中表达量最高, 其次是唾液腺; HaJNK2 在头部表达量最高, 其次是性腺。取食Cry1Ac的4龄棉铃虫幼虫的中肠组织中, HaJNK1 与 HaJNK2 的表达量均显著升高。推测 HaJNKs 基因可能参与棉铃虫抵御Bt杀虫蛋白伤害的应激和抗逆反应。     

北京葡萄溃疡病病原菌Lasiodiplodia citricola的鉴定和生物学特性初探

Botryosphaeria dieback is one of the important grapevine trunk diseases in the world. In this study, two grapevine trunk disease samples were collected from two grape vineyards in Miyun District of Beijing, where grapevine trunk disease was very severe. The potential pathogens were isolated, purified and identified. Meanwhile this study conducted to evaluate the pathogenicity by Koch’s Postulate, and the effects of temperature and light on the growth of pathogens. According to morphological characteristics and a multi-gene phylogenetic analysis with sequences of ITS, EF-1α and TUB, four isolates were identified as Lasiodiplodia citricola, which was the causal organism of grapevine Botryosphaeria dieback. Moreover, the pathogen was able to grow between 10-40 ℃. The optimum temperature for mycelial growth was 30 ℃, and it grew rapidly under full light. This is the first report of grapevine Botryosphaeria dieback disease on grapes caused by L. citricola in China.     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

豌豆蚜特异性扩张分支气味受体基因的克隆及表达分析

豌豆蚜Acyrthosiphon pisum气味受体家族存在明显扩张现象,推测在豌豆蚜寄主适应过程中起着重要作用。本研究旨在克隆豌豆蚜特异性扩张分支上的气味受体基因,明确这些气味受体基因在不同组织中的表达水平。通过PCR技术克隆特异性扩张分支上气味受体基因的全长序列,采用实时荧光定量RT-qPCR技术测定这些基因在触角及足中的表达水平。克隆获得豌豆蚜特异性扩张分支中4个气味受体基因全长序列(GenBank登录号：OL739156-OL739159),分别编码374～376个氨基酸,序列相似性较高,为68.09%～83.11%,均具有7个跨膜结构域。荧光定量RT-qPCR结果显示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成虫触角及足中均有表达,其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在触角中偏好表达,ApisOR13基因在触角中的表达量最高。本研究为解析豌豆蚜特异性扩张气味受体的功能提供了分子基础。     

水稻热休克蛋白HSP70基因克隆、表达分析及原核表达

为明确水稻热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因在逆境胁迫下的表达特征,以日本晴粳稻水稻品种为材料,通过基因克隆方法获得水稻HSP70基因cDNA全长序列,并采用生物信息学的方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术测定不同水稻组织、不同激素、不同温度以及不同逆境下HSP70基因的相对表达量,同时对其原核表达条件进行优化。结果表明,水稻HSP70基因全长1 950 bp,预测蛋白大小为71.18 kD,等电点为5.10,亚细胞定位于细胞质内,有较强的亲水性。水稻HSP70蛋白序列与香蕉HSP70蛋白序列的亲缘性较高;水稻HSP70基因表达具有组织特异性,在茎中的相对表达量最高,在根中最低;低温胁迫后,水稻HSP70基因在12 h内基因相对表达量相对稳定,在24 h时相对表达量达到峰值,为9.60;高温胁迫后,在较短时间内水稻HSP70基因显著上调并达到峰值,为79.10;激素吲哚乙酸、脱落酸和油菜素内酯均能诱导水稻HSP70基因表达;但在甘露醇模拟干旱和NaCl盐胁迫处理下,水稻HSP70基因的相对表达量呈现先升后降的趋势。水稻HSP70蛋白的最佳诱导温度是30℃,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷最佳诱导浓度为1.2 mmol/L。