黏虫生殖相关脂蛋白受体基因的克隆与时空表达分析

为明确脂蛋白受体（lipophorin receptor,LpR）在黏虫Mythimna separata生殖中的潜在作用,采用反转录PCR技术克隆黏虫的2个LpR基因cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR技术分析其在黏虫雌虫不同发育时期和组织中的时空表达谱。结果表明,从黏虫中克隆得到的2个LpR基因分别命名为MsLpR-1和MsLpR-2,其开放阅读框分别为1 857 bp和1 935 bp,分别编码618个和644个氨基酸;且均具有LpR家族典型的5个结构特征,其区别位于表皮生长因子前体同源结构域和O-糖链连接结构域之间插入或缺失29个氨基酸。MsLpR-1和MsLpR-2基因在黏虫雌虫不同发育阶段均有表达,在5日龄雌成虫中的表达量最高,分别是1日龄雌蛹中表达量的2.70倍和3.72倍。2个LpR基因均在雌成虫卵巢和中肠中显著上调表达,其中MsLpR-1基因在卵巢和中肠中的表达量分别是头部表达量的67.28倍和222.15倍,而MsLpR-2基因在卵巢和中肠中的表达量分别是头部表达量的5.27倍和5.64倍,此外MsLpR-2基因还在脂肪体和胸部中显著上调表达,其表达量分别是头部表...     

粘虫脂动激素基因MsepAKH1的克隆与成虫期表达模式分析

为明确脂动激素基因AKH在粘虫Mythimna separata(Walker)能源代谢过程中的作用,采用RT-PCR和RACE技术克隆得到粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA全长,并通过实时荧光定量PCR技术测定该基因在成虫期的组织与发育阶段表达模式。结果表明,粘虫脂动激素基因MsepAKH1的cDNA序列全长为449 bp,GenBank登录号为KP979739.1,开放阅读框为207 bp,编码68个氨基酸,具有昆虫脂动激素基因家族典型的结构特征;预测该基因编码的MsepAKH1蛋白分子量为7.61 kD,等电点为8.46,MsepAKH1的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta、二化螟Chilo suppressalis、小菜蛾Plutella xylostella、棉铃虫Helicoverpa armigera、家蚕Bombyx mori的AKH氨基酸序列同源性较高。MsepAKH1基因在粘虫初羽化雌蛾不同组织间的表达量差异显著,主要在头部和飞行肌内表达,分别约为同日龄雌蛾脂肪体内表达量的15.4倍与8.1倍,在脂肪体、卵巢与中肠内的表达量显著降低。对不同日龄雌蛾头部和飞行肌内的表达量检测发现,在7日龄雌蛾头部和3日龄雌蛾飞行肌内的表达量分别显著高于其它日龄雌蛾相同组织中的表达量,分别约为初羽化雌蛾相同组织表达量的2.4倍与1.6倍。表明MsepAKH1基因的表达因粘虫雌蛾组织与日龄间的不同而呈现动态变化。     

双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco的克隆、分子特征及表达

为了解新发现的农业害虫双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)非典型嗅觉受体Orco的分子特征与表达,通过分析转录组数据并利用RT-PCR技术克隆了双委夜蛾Orco基因,并采用实时定量PCR技术研究了该基因的组织表达谱。结果显示,双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco基因开放阅读框全长1 422 bp,编码473个氨基酸,经氨基酸结构预测具有7个跨膜区,N端在膜内,C端在膜外;该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫Orco序列相似性极高,因此将该基因命名为Adis Orco(Gen Bank登录号:KR632987),此氨基酸序列C末端第6跨膜区和第7跨膜区之间以及第7跨膜区的序列保守性最高;PCR结果显示,Adis Orco主要在成虫触角中表达,且在雄蛾触角中的表达量是雌蛾触角中的4.2倍,在足、翅、下唇须和喙等组织中也有少量表达。     

Harelish负向调控棉铃虫性信息素生物合成机制的初步研究

性信息素是蛾类昆虫通讯的关键信号分子,其生物合成机制已在家蚕Bombyx mori、棉铃虫Helicoverpa armigera和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis等蛾类中明确了,但其负向调控机制尚不明确。本文探索了Harelish基因在棉铃虫雌蛾性信息素生物合成中的作用。结果发现,Harelish基因在棉铃虫雌蛾中肠、表皮、脑、触角、脂肪体、肌肉和性信息素腺体等7个组织中均有表达,且在羽化后随着性信息素生物的合成和释放而高丰度表达。基于RNAi降低Harelish基因转录水平的表达量后,其性信息素含量和钙调磷酸酶活性均显著上升,表明Harelish通过抑制钙调磷酸酶活性负向调控了性信息素的生物合成。该研究为利用性信息素生物合成的终止信号为分子靶标来防控害虫奠定理论基础。     

棉铃虫表皮蛋白基因的克隆、序列及表达分析

昆虫表皮蛋白能帮助昆虫抵御外界不良环境,在昆虫的生长发育中起重要作用。基于棉铃虫Helicoverpa armigera（Hübner）转录组数据信息克隆获得表皮蛋白基因的cDNA序列,通过Real-time PCR探讨棉铃虫各龄期和组织表皮蛋白的相对表达量。在棉铃虫体内得到HACPFL67 cDNA开放阅读框（KP072002）612 bp,命名为HACPFL67,编码204个氨基酸,分子量约为20.892 kDa,等电点7.275,序列包含有表皮蛋白的保守序列,与鳞翅目夜蛾科昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens和斜纹夜蛾Spodoptera litura等亲缘关系较近,与烟芽夜蛾氨基酸序列相似性高达83%。棉铃虫HACPFL67在不同发育阶段和组织中表达存在很大差异,其中4龄幼虫在各个发育阶段表达最高。综上所述,棉铃虫HACPFL67相对表达量在不同组织和发育时期存在一定差异。     

三叶斑潜蝇热激蛋白Hsp90基因的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

采用RT-PCR及RACE技术克隆了三叶斑潜蝇Hsp90基因全长cDNA序列,并用实时定量RT-PCR的方法检测其在不同发育阶段受到高温胁迫后的表达水平。该基因的cDNA序列全长2 408 bp,开放阅读框为2 145 bp,编码714个氨基酸;5′非编码区为151 bp,3′非编码区为112 bp。该基因推导的氨基酸序列与其他昆虫同源序列比较有很高的相似性（80%~99%）。聚类分析结果显示三叶斑潜蝇与美洲斑潜蝇和南美斑潜蝇的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测结果表明三叶斑潜蝇Hsp90基因的表达受到热胁迫的诱导,诱导3龄幼虫最大表达量的温度比诱导其他发育阶段的温度低,在43 ℃时预蛹和蛹的表达量在整个生命周期中最高,在检测的高温胁迫条件下,雄虫比雌虫的表达量更高。该结果为阐明三叶斑潜蝇胁迫耐受能力及其对其他潜蝇种群的取代机制奠定了分子基础。     

粘虫过氧化物酶MsPOD基因的克隆及不同温度胁迫的诱导效应

过氧化物酶（POD）是昆虫体内一种很关键的抗氧化酶,在维持昆虫体内氧化还原的动态平衡及保护昆虫免受氧化损伤方面起到重要的作用。本试验通过转录组测序方法获得一条粘虫过氧化物酶基因的cDNA序列,该序列命名为MsPOD（GenBank登录号：MH606240）。该序列全长2433 bp,开放阅读框长度为2061 bp,编码686个氨基酸组成的多肽,分子量约76.1 ku,等电点5.68,具有1个标志性的动物亚铁血红素过氧化物酶细胞粘附蛋白结构域。氨基酸序列比对表明,MsPOD的氨基酸序列与鳞翅目夜蛾科其他昆虫亲缘关系较近,其中与棉铃虫POD氨基酸序列同源性最高,达92%。基因表达水平研究发现,MsPOD基因在不同发育阶段和不同组织中差异表达,在蛹期和唾腺中表达量最高。温度梯度诱导后,MsPOD基因在不同时间点的表达量具有显著差异,经35℃下12 h处理后表达量最高。研究结果为进一步研究过氧化物酶在昆虫体内的保护性作用以及利用该基因进行分子设计来防治粘虫奠定理论基础。     

饥饿胁迫下黑肩绿盲蝽转录组分析及S6K基因功能分析

为扩大黑肩绿盲蝽Cyrtorhinus lividipennis的人工繁殖规模,利用RNA-seq技术对饥饿胁迫2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫进行转录组测序分析,筛选参与生殖调控的相关信号通路,挖掘直接或者间接影响生殖的相关基因,采用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantification PCR,qRT-PCR）对筛选的相关基因进行验证,并通过试验分析沉默S6K基因和饥饿处理对黑肩绿盲蝽生殖的影响。结果显示,与取食褐飞虱Nilaparvata lugens卵（CK）的黑肩绿盲蝽相比,饥饿处理2 d的黑肩绿盲蝽雌成虫有11 675个基因差异表达,其中有4 264个基因表达量上调,7 411个基因表达量下调。共筛选到7条与生殖调控相关的信号通路和6个与生殖调控相关的基因,除TSC2基因表达量上调外,其他S6K、INSR、Akt、HSP70-1、HSP70-2五个与生殖相关基因的表达量在7条生殖相关信号通路中均下调。qRT-PCR检测结果与转录组测序结果一致,说明转录组分析结果可靠。沉默S6K基因后,黑肩绿盲蝽雌成虫脂肪体和卵巢蛋白质含量、Vg基因表达量、雌成虫产卵量和Vg含量较对照显著降低。此外,饥饿处理2 d后黑肩绿盲蝽雌成虫产卵量也较对照显著减少。表明饥饿胁迫后黑肩绿盲蝽雌成虫的生殖相关通路可能受多个信号通路调控,S6K表达量下降显著影响黑肩绿盲蝽的生殖。     

近零磁场下东方黏虫转录组分析

为进一步探究黏虫的磁感应机制,明确磁场强度变化对黏虫相关基因表达的影响及相应的分子机制,本研究利用亥姆霍兹线圈装置产生近零磁场,使用Illumina技术,分别对近零磁场(小于500 nT)和地磁场(约54 000 nT)下饲养的黏虫雌蛾和雄蛾进行转录组测序分析。结果表明:相对于地磁场,近零磁场下雌、雄蛾分别鉴定出1 670和1 401个差异表达基因,其中雌蛾鉴定出614个上调基因,1 056个下调基因;雄蛾鉴定出545个上调基因,856个下调基因;雌、雄蛾共同差异表达基因274个。GO功能分析和pathway结果显示近零磁场胁迫与离子结合、催化和代谢等关键过程密切相关。对选取的10个差异基因进行荧光定量PCR验证,证明了转录组测序分析结果准确可靠。本试验为深入探究迁飞性昆虫的地磁定向机制提供了理论基础。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区（47～103）,催化区（199～355）,低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36%~38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。     

棉铃虫5-HT1和5-HT2基因的克隆及表达模式分析

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是昆虫体内一种重要的生物胺,其通过结合特异性的G蛋白偶联受体在昆虫体内发挥不同的神经调控作用。本研究基于转录组测序数据结合RT-PCR技术鉴定克隆了棉铃虫5-HT受体基因5-HT1和5-HT2,采用生物信息学方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测了其在幼虫和成虫不同组织内的表达特征。结果显示,棉铃虫体内分别表达5-HT的2类受体基因：5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2B。系统进化树分析表明,棉铃虫5-HT受体基因分为3个不同分支,而5-HT1和5-HT2可明显分别分成2个不同分支,各分支均与家蚕和烟草天蛾5-HT相应受体基因具有较高的同源性。RT-qPCR结果显示,在幼虫期,4种5-HT受体基因都在头部显著高表达,成虫期除在脑部高表达外,在触角或腹部也有高表达。其中5-HT1A和5-HT1B在雌成虫触角表达量显著高于雄成虫触角,5-HT1A和5-HT2B在雌成虫腹部表达量显著高于雄成虫腹部,而5-HT1B在雄成虫腹部表达量显著高于雌成虫腹部。以上结果表明5-HT1和5-HT2...     

黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因(allatostatin,AST)在调控黏虫Mythimna separata(Walker)保幼激素(juvenile hormone,JH)中的功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902bp,开放阅读框378bp,编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33kD,等电点为9.25,具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明,黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高,头部其次,卵巢最低;黏虫头部AST表达量在7日龄最高,飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用,明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。     

昆虫激脂激素的功能及作用机制研究进展

激脂激素（adipokinetic hormone,AKH）是昆虫体内调节能量稳态的重要内分泌神经多肽,能够促进脂肪体中营养储存物质的分解,在维持昆虫高耗能生命活动中具有关键作用。AKH的研究在早期多围绕昆虫飞行及爬行等运动活动中促进甘油三酯、糖元等物质分解的功能和信号传导机制。近年来的研究发现,AKH/膜受体AKHR通路也参与促进卵黄发生和后代哺育过程中营养物质的调动。另外,AKH在抗氧化、忍耐饥饿和免疫等逆境响应中的稳态维持也具有重要作用。越来越多的研究证明,作为重要的能量物质动用激素,AKH是一种参与多种生理活动的多效性调控因子。本文就AKH/AKHR信号通路在昆虫运动、生殖及抗胁迫等生理活动中功能和作用机制的研究进展进行总结和论述,以期为进一步阐明AKH在昆虫能量稳态调控中的分子机制提供帮助,并为解析害虫远距离迁飞、大量繁殖以及抗环境胁迫的分子基础和遗传调控机理提供参考。     

褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domain serine protease,CSP）是广泛存在于昆虫体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类,在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定获得一个褐飞虱CSP编码基因NlCSP4（GenBank登录号：OK018340）,其cDNA序列全长1911 bp,编码636个氨基酸,预测蛋白质分子量为69.29 kD,等电点为9.02。NlCSP4蛋白N端包含一段由25个氨基酸残基组成的信号肽和一段由44个氨基酸残基组成的clip结构域,C端具有CSP蛋白家族典型的Tryp_SPc结构域,且其中包含特异性保守的His-Asp-Ser催化中心三元件。系统发育分析表明NlCSP4与其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ进化树上聚为一支,而与鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,NlCSP4基因表达具有明显的时空特异性,其在雌成虫中的表达量最高,且高龄若虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄若虫期;NlCSP4基因在褐飞虱雌成虫脂肪体、肠道和卵巢中均有表达,且在脂肪体中表达量最高;金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）和金龟子绿僵菌（丝状病原真菌）诱导72 h内NlCSP4表达量均显著上调,但大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）短时间（36 h内）诱导效果不明显。显微注射NlCSP4基因dsRNA可显著抑制褐飞虱5龄若虫NlCSP4的表达水平。生物测定试验表明,NlCSP4干扰后褐飞虱5龄若虫存活率显著下降,且对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力显著降低。本研究结果初步证实了褐飞虱NlCSP4在宿主生长发育和免疫防御过程中发挥重要调控作用,可作为开发RNAi介导的褐飞虱防控技术中的一个重要潜在靶标。     

烟粉虱MED隐种蜕皮激素受体基因cDNA克隆、转录与组织表达

蜕皮激素受体(ecdysone receptor,Ec R)是调控昆虫蜕皮、变态和生殖等过程中基因表达的重要调控因子。为研究Ec R在烟粉虱Bemisia tabaci生长发育中的作用,利用RT-PCR和RACE等技术扩增了烟粉虱MED隐种Ec R基因的c DNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在烟粉虱不同发育时期相对表达量的变化。Bt Ec R c DNA序列全长2 844 bp,含有一个1 518 bp的开放阅读框,共编码505个氨基酸,预测蛋白分子量为56 k D,等电点为6.43,含有特殊结构功能域:DNA结合域(DBD_Ec R)和配体结合域(LBD_Ec R),该序列编码的蛋白质序列与其它已报道的昆虫Ec R蛋白序列具有很高的相似性,命名为Bt Ec R(Gen Bank登录号:KR534774)。Bt Ec R在MED隐种若虫、雌成虫各发育时期均有表达,若虫期在伪蛹前期达到最高值,成虫期呈现先升高后降低的趋势,且在羽化后第7天达到最高值,约为羽化第1天的23倍。研究结果为揭示Bt Ec R在烟粉虱整个生长发育过程中的作用提供了重要依据。     

稻曲病气象风险评估及适宜度等级预测技术

为了弄清适宜稻曲病发生发展的气象条件以及对应的气象适宜度等级,提高水稻气象型病害防控能力,本文利用江苏省稻曲病大田调查资料,结合历史气象资料,通过评估发病敏感时段和致病风险,以及分析江苏省稻曲病最大成灾风险度出现日期以及空间分布情况,指出8月下旬为稻曲病高发期,对于发病风险高且程度重的沿淮、沿江以及江淮之间地区需要加强病害防御。在此基础上,综合考虑不同连续致病天数对稻曲病流行的影响,利用最优化技术,构建了综合稻曲病指数,并划分气象条件适宜度等级。通过单站和多站检验发现该指数对"中等、大流行"发病实况的判定准确率极高,但容易高估"轻度流行"的程度。