蒙古牛MSTN基因序列分析及多态性研究

以PCR扩增及测序的方法,检测了新疆巴音布鲁克自治区的18头蒙古牛样本的MSTN基因。结果显示：蒙古牛MSTN基因编码区含1128个碱基对,在所检蒙古牛样本中,存在1个核苷酸多态位点,含有两种核苷酸类型（55．6％C和44．4％T）;在该位点上,欧洲牛（T）、瘤牛（C）和牦牛（C）均为单型。说明了蒙古牛与欧洲牛、瘤牛和牦牛起源相似,存在一定的基因分化,但未达属层次的分化水平。     

蒙古牛MSTN基因多态性研究

针对牛肌肉生长抑制素基因编码区设计引物,以PCR扩增及测序的方法,检测了新疆巴音布鲁克自治区的18头蒙古牛样本.结果显示:蒙古牛肌肉生长抑制素基因编码区含1 128个碱基对,通过比对,在所检蒙古牛样本中,存在1个核苷酸多态位点,含有2种核苷酸类型(C 55.6%和T 44.4%);在该位点上,欧洲牛(T)、瘤牛(C)和牦牛(C)均为单型.说明了蒙古牛与欧洲牛、瘤牛和/或牦牛三者间存在一定的基因交流,但根据本研究无法确定蒙古牛是与瘤牛,还是与牦牛发生基因交流.     

渤海黑牛和日本和牛MSTN基因的比较分析

利用PCR扩增及测序的方法,分别对渤海黑牛和日本和牛的MSTN基因编码序列进行分析.结果显示:与日本和牛相比,渤海黑牛MSTN基因外显子1的111 bp处存在一个突变位点,在其外显子2和外显子3处进行比较分析,发现与NCBI上牛的序列一致,没有发生改变的位点.     

渤海黑牛和日本和牛MSTN基因的比较分析

利用PCR扩增及测序的方法,分别对渤海黑牛和日本和牛的MSTN基因编码序列进行分析。结果显示:与日本和牛相比,渤海黑牛MSTN基因外显子1的111 bp处存在一个突变位点,在其外显子2和外显子3处进行比较分析,发现与NCBI上牛的序列一致,没有发生改变的位点。     

中国牛属4个物种MSTN基因的遗传变异研究

针对牛肌肉生长抑制素基因（MSTN）3个外显子区设计引物,通过PCR扩增及测序,以蒙古牛、雷琼牛、独龙牛、巴音郭楞州牦牛共66个样本为材料检测了中国普通牛、瘤牛、大额牛和牦牛4个牛属该基因外显子区核苷酸序列的变异。结果显示,4个中国牛种的MSTN基因外显子1、2和3分别含375、372、381个碱基对,在所检样本中,发现7个核苷酸多态位点,定义17种单倍型;种内核苷酸歧异度（Pi）在0.000 36-0.001 03间,种间核苷酸歧异度（Dxy）在0.000 76-0.003 22间,说明群体内遗传多样性程度低;以单倍型序列为基础构建的分子进化树表明,牦牛的分化早于黄牛中普通牛和瘤牛的分化;大额牛明显分为2个类群,很可能是由于杂交造成的。     

绵羊MSTN基因结构和功能的生物信息学分析

为了研究绵羊肌肉生长抑制素(MSTN)基因结构和功能,试验采用生物信息学方法对其编码蛋白的结构、理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、功能分类、二级结构、高级结构和功能结构域进行生物信息学分析并推测与其他物种的生物进化关系.结果表明:绵羊MSTN蛋白是一个疏水性不稳定蛋白,作为信号肽的可能性很大；含有9个α-螺旋、1...     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

滩羊肌肉抑制素(MSTN)基因的多态性研究

为了分析宁夏滩羊肌肉抑制素(MSTN)基因的遗传多样性及其与生长性状的相关性,试验对滩羊群体的98个个体的MSTN基因进行PCR-RFLP分析。结果表明:MSTN基因引物1在所选群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态,多态信息含量为0.301 5,属于中度多态,2个等位基因分别为:A、a,3种基因型分别为:AA、Aa、aa,有效等位基因数为1.586 9,杂合度为0.369 8。MSTN基因引物2也处于Hardy-Weinberg平衡状态,多态信息含量为0.366 4,属于中度多态,2个等位基因分别为:A、B,3种基因型分别为:AA、AB、BB,有效等位基因数为1.934 7,杂合度为0.483 1。     

小鼠MSTN基因RNA干涉载体的构建及干涉效率的检测

为了筛选小鼠肌肉生长抑制素(MSTN)基因的干涉序列,根据GenBank中小鼠的MSTN基因序列,采用RT-PCR方法克隆获得MSTN基因序列,构建其真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;根据MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因干涉序列(M1、M2、M3),并构建相应的RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3。将构建的真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN单独或分别与3种干涉载体共转染293GP细胞,检测干涉载体对MSTN基因的干涉效率。结果表明:试验成功克隆得到与GenBank中的序列同源性为99.91%的小鼠MSTN基因序列,并构建了真核表达载体pcDNA 3.1(+)-MSTN;与转染pcDNA 3.1(+)-MSTN后的293GP细胞中MSTN基因的相对表达量(1.000)相比,转染pRNAT-M1、pRNAT-M2、pRNAT-M3后MSTN基因相对表达量明显下降,pRNAT-M1的干涉效率最高。说明研究成功获得对MSTN基因表达具有明显干涉作用的干涉序列。     

CRISPR-Cas9介导的蒙古牛MSTN基因敲除细胞系的建立

试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。     

牛肌肉生成抑制素基因第一内含子部分序列的遗传变异分析

应用PCR-SSCP分析方法,对88头肉牛的肌肉生成抑制素基因(MSTN)的第1内含子部分序列进行了多态性分析.结果发现,在MSTN基因第1内含子819～1 127bp处存在6种基因型,即AA、BB、CC、AB、BC和AD.对该多肽片段克隆测序,结果共存在4种等位基因A、B、C和D.经统计发现,在夏洛莱牛群体中,等位基因A出现的频率较高,达到78.37%,等位基因C的频率为0;在西门塔尔牛群体中,等位基因B的频率较高,为54.90%,而等位基因D的频率为0.     

雷琼牛肌肉生长抑制素基因序列研究

通过PCR方法对18头雷琼牛的MSTN基因进行扩增、测序.编码区序列分析结果表明:雷琼牛MSTN基因比外域瘤牛存在较丰富的多态性,共发现4个突变位点(2个转换,2个颠换),定义了6种单倍型,群体单倍型多样性较高(0.810±0.057);分析结果表明:MSTN基因的相关突变的发生可能早于Bos属瘤牛、普通牛、牦牛的分化;在瘤牛种内,我国南方的瘤牛可能是更原始的种群.     

雷琼牛肌肉生长抑制素基因序列研究

通过PCR方法对18头雷琼牛的MSTN基因进行扩增、测序。编码区序列分析结果表明：雷琼牛MSTN基因比外域瘤牛存在较丰富的多态性,共发现4个突变位点（2个转换,2个颠换）,定义了6种单倍型,群体单倍型多样性较高（0．810±0．057）;分析结果表明：MSTN基因的相关突变的发生可能早于Bos属瘤牛、普通牛、牦牛的分化;在瘤牛种内,我国南方的瘤牛可能是更原始的种群。     

中国牛亚科6个物种MSTN基因外显子2多态性及分化研究

采用PCR扩增了6个中国牛种共101个样本的MSTN基因外显子2的编码区,序列分析显示,MSTN基因外显子2编码区含372个碱基对,在所检测样本中,存在10个核苷酸多态位点,定义了7种单倍型,雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴音郭楞牦牛享有共同的单倍型;MSNT基因外显子2在6个牛种中多态性较丰富。结果表明:两水牛与牛属群体间分化明显;牛属群体中牦牛独自聚成一类;大额牛存在一个独立分支;雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和瘤牛聚成一支,说明蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,亲缘关系较远;研究证实了水牛的属分类地位,一定程度上支持牦牛及大额牛划为牛亚科中单独的一个属。     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

贵州关岭黄牛POMC基因多态性分析

为研究阿片黑皮质素前体(POMC)在动物采食和能量平衡中的作用,本研究采用DNA测序技术,对关岭黄牛92头个体的POMC基因的多态性进行研究。结果表明,在扩增片段为870 bp的产物中,发现138CT,430CT,644CT,668CT,693AG 5个突变位点。多态性结果显示,除430CT突变位点处于哈代-温伯格不平衡状态(HWE)(P0.05),其余突变位点均处于HWE平衡状态(P0.05),5个突变位点的多肽信息含量(PIC)均为中度多态。     

西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析

本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。