青蛤(Cyclina sinensis)IRAK-4基因的克隆及其组织间的表达分析

利用转录组测序获得了青蛤(Cyclina sinensis)白介素-1受体相关激酶-4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK-4)基因的序列信息,利用巢式及荧光定量PCR克隆并分析了Cs IRAK-4基因在青蛤各组织中的表达情况,进一步在鳗弧菌的胁迫下检测了Cs IRAK-4基因在青蛤血淋巴中的时序表达情况。结果显示,Cs IRAK-4基因的序列全长共2 687 bp,其开放阅读框长1 926 bp,共编码641个氨基酸,Cs IRAK-4基因在青蛤的血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌、性腺和鳃中均表达,其中在血淋巴中表达量最高,肝脏中表达量最低。青蛤在鳗弧菌胁迫下该基因的表达量在3 h即达到最大值,与对照组差异极显著(P0.01),证明该基因所表达的产物是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。     

不同病原菌胁迫下青蛤血淋巴转录组中免疫相关基因的比较

利用病原微生物革兰氏阳性藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和革兰氏阴性鳗弧菌(Vibrio anguillarum)分别侵染活体青蛤,采用第二代测序Mi Seq技术测序,构建了青蛤血淋巴中应答2种病原物的转录组文库。根据KEGG等数据库注释信息对Unigene进行生物学通路注释,预测出青蛤免疫信号通路的差异性表达基因及相关注释信息。结果发现,共注释并筛选出2 605个差异表达基因,其中893个基因注释到15个免疫相关的通路中。该研究可为探索青蛤的免疫识别方式和信号传导路径提供依据。     

养殖水体中二种溶解态铜对凡纳滨对虾生长和免疫功能的影响

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用慢性富集方式,测定了56 d内不同浓度梯度、不同溶解态下的铜对凡纳滨对虾体内不同器官组织所含免疫活性物质影响。实验分为5组,分别为无铜添加的对照组;两组分别使用0. 15 m~2铜板/m3和0. 30 m~2铜板/m~3的LC6911型耐腐蚀合金铜作为络合C铜源;另外两组定量添加与络合铜组释放铜量匹配的CuSO_4·5H_2O。结果表明:(1)在无养殖生物的水体中,实验用LC6911型耐腐蚀合金铜平铺2 m~3玻璃钢桶底,铜板在海水中48 h释放总铜与铜板面积呈正比关系。(2)络合铜实验组在两种浓度梯度下均能使铜蓝蛋白(CP)、还原态酚氧化酶(POX)和金属硫蛋白(MT)活性提升,且实验结束时显著高于对照组(P 0. 05)。(3)虾血淋巴中溶菌酶活性在2种不同溶解态铜的实验组中,实验结束时均表现出与对照组呈显著性差异(P 0. 05),两种不同溶解态铜之间以及不同水平之间都没有达到显著性差异。在鳃组织中络合铜实验组的溶菌酶活性与对照组之间均无显著性差异(P 0. 05),而Cu~(2+)组的溶菌酶活性出现显著下降(P 0. 05)。(4)长期养殖生长数据表明,在实验结束时各实验组与对照组之间生长效果并不显著。养殖水体使用络合铜对凡纳滨对虾免疫活性及生长效果的提升较Cu~(2+)更为突出,用量低于0. 3 m~2铜板/m3长期使用不会对凡纳滨对虾免疫系统造成损伤。     

复方大蒜油添加剂对中国对虾免疫机能的增强作用

从大蒜中提取大蒜油，配以从多种中草药中提取的皂甙类天然活性物质，组成复方制剂，以０．２％的比例添加于对虾饲料中，对中国对虾（Ｐｅｎａｎｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）体液免疫功能和提高防病能力的作用进行研究．结果表明，对虾血细胞吞噬率、杀伤率和吞噬指数有极显著提高（Ｐ＜０．０１），血细胞杀伤指数显著提高（Ｐ＜０．０５）；对虾血淋巴中的溶菌活力极显著提高（Ｐ＜０．０１），酚氧化酶活力显著提高（Ｐ＜０．０５）；溶藻弧菌攻毒后，对虾免疫保护率提高８６％（Ｐ＜０．０１）．该添加剂经对虾口服后，可显著提高其免疫功能，有效地预防对虾受溶藻弧菌的感染     

复方大蒜油添加剂对中国对虾免疫机能的增强作用

从大蒜中提取大蒜油，配以从多种中草药中提取的皂甙类天然活性物质，组成复方制剂，以０．２％的比例添加于对虾饲料中，对中国对虾体液免疫功能和提高防病能力的作用进行研究。结果表明，对虾血细胞吞噬率、杀伤率和吞噬指数有极显提高（Ｐ〈０．０１），血细胞杀伤指数显提高（Ｐ〈０．０５）；对虾血淋巴中的溶菌活力极显提高（Ｐ〈０．０１），酚氧化酶活力显提高（Ｐ〈０．０５）；溶藻弧菌攻毒后，对虾免疫保护率提高     

铵态氮、亚硝酸盐氮对三角帆蚌免疫酶活性的影响

采用浓度为0.5,1.0,2.0,4.0 mol/L NH4-N和0.2,0.4,0.8,2.0 mg/L NO2-N的水体养殖三角帆蚌20d,分析不同浓度的NH4-N,NO2-N对三角帆蚌非特异性免疫相关酶活性的影响。结果表明:三角帆蚌肝脏中的溶菌酶(Lysozyme,LSZ)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性及对NH4-N、NO2-N的敏感性均高于血淋巴中的活性和敏感性;0.5 mol/L NH4-N和0.2 mol/L NO2-N组三角帆蚌血淋巴中ACP活性均高于对照组,其余各实验处理组随着NH4-N、NO2-N浓度的升高,三角帆蚌非特异性免疫相关酶的活性明显降低。说明水体中高浓度的NH4-N和NO2-N能降低三角帆蚌的非特异性免疫活力。     

凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA组织表达的差异研究

采用荧光定量PCR技术,检测了凡纳滨对虾不同组织(血淋巴、鳃、肌肉和肝胰腺)中Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量。结果表明:凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA在不同组织间的表达量存在显著差异。Toll受体mRNA在各组织中的相对表达水平由高到低顺序依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺。溶菌酶mRNA表达水平则依次为血淋巴>鳃>肌肉>肝胰腺,但血淋巴和鳃之间无显著差异。溶菌酶mRNA和Toll mRNA表达量重复测定间的变异度在血淋巴和鳃组织间无显著差异。表明鳃和血淋巴是检测凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的相对表达量的理想实验材料。研究亮点:Toll受体能够将异物入侵的信号从细胞外传递到细胞内并引起胞内信号级联反应产生各种免疫效益因子,因此其表达水平一定程度上可以反映对虾对病原入侵的灵敏性。溶菌酶活性是评判对虾免疫抗菌能力的重要指标。研究Toll受体和溶菌酶基因表达的组织差异性,可以为后续开展对虾营养免疫学研究中免疫相关基因检测时实验材料的选取提供理论基础。     

水温骤降后凡纳滨对虾血清中NO、NOS水平及对副溶血弧菌的敏感性

测定了水温骤降后(A组(25→22℃)、B组(25→19℃)、C组(25→16℃)、对照组(25℃))6、24 h凡纳滨对虾Penaeus vannam ei血清中一氧化氮(NO)的浓度、一氧化氮合成酶(n i-tric oxide synthase,NOS)的活性以及溶菌酶活力的变化,并在水温变化后24 h用副溶血弧菌Vibrioparahaem olyticus对对虾进行人工感染,以评价凡纳滨对虾对副溶血弧菌的敏感性。结果表明,水温骤降后6 h,各试验组对虾血清中NO浓度、NOS活性、溶菌酶活力均与对照组差异不显著(P>0.05)。水温骤降后24 h,B组对虾血清中NO浓度显著高于对照组(P<0.05),A、C两组与对照组差异不显著(P>0.05);B组对虾血清中NOS的活性显著高于对照组(P<0.05),C组显著低于对照组(P<0.05),A组与对照组差异不显著(P>0.05);各试验组对虾血清中的溶菌酶活力与对照组差异不显著(P>0.05);用副溶血弧菌人工感染对虾的死亡率C组为58.3%,与对照组(33.3%)存在显著差异(P<0.05)。这说明水温大幅度急剧下降后,凡纳滨对虾血清中的NOS活性、溶菌酶活力下降,因而导致凡纳滨对虾对副溶血弧菌的敏感性升高。     

饲料胆固醇含量对凡纳滨对虾免疫相关基因表达及耐低温低溶解氧胁迫能力的影响

为探究饲料中胆固醇含量对淡水养殖凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)免疫相关基因表达及耐低温低溶解氧胁迫能力的影响,在鱼粉含量为10%的基础饲料中分别添加0、1.0、2.0、3.0、4.0 g/kg的胆固醇,制成5组等氮等能饲料(C0、C1、C2、C3和C4,实测胆固醇含量依次为0.78、1.57、2.45、3.43和4.18 mg/g)投喂初始体质量为(0.14±0.03) g的凡纳滨对虾。养殖8周后检测对虾耐低温和低溶解氧胁迫的能力以及急性感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后免疫相关基因(Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA)相对表达量。结果表明:饲料胆固醇含量显著影响弧菌急性感染后对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA相对表达量。在弧菌感染进程中,C2组对虾Toll受体和溶菌酶的mRNA表达量表现出最大的变化幅度;而IMD mRNA表达量最大变化幅度出现在C1组,其次为C2组。急性感染弧菌后各组对虾Toll受体和溶菌酶mRNA相对表达量峰值均出现在感染后24 h;C2、C3和C4组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后24 h,而C0和C1组IMD mRNA表达量峰值出现在感染后42 h。急性程序降温胁迫下,C0和C4组对虾100%死亡的温度为15℃;而其他组对虾100%死亡的温度为14℃。急性低溶解氧胁迫下各组对虾的耗氧量和致死溶氧浓度无显著性差异。综上所述:在淡水养殖条件下,饲料中2.45 mg/g的胆固醇含量可以提高凡纳滨对虾的免疫灵敏性,而饲料中胆固醇含量为(1.57～3.43) mg/g时凡纳滨对虾表现出较好的抗低温胁迫能力。     

鳗弧菌vah1缺失菌株构建及致病性评估

为了构建减毒鳗弧菌菌株,本文通过基因重组和Overlap PCR技术,敲除鳗弧菌中的毒力基因vah1,构建vah1缺失鳗弧菌菌株△vah1,缺失菌株△vah1的生长速率没有变化,溶血活性下降了9.5倍,生物膜形成能力下降。通过感染凡纳滨对虾,得出野生菌株的半数致死量为(3.16±0.8)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株△vah1的半数致死量为(9.77±0.5)×10_⁵ cfu/mL,缺失菌株的半数致死量提高了约3.09倍,在对虾体内的定植能力下降了约3倍左右,对凡纳滨对虾的肝胰腺细胞造成的溶解和空泡化的破坏程度下降了,引起凡纳滨对虾的免疫基因CAT、SOD、PO、LZM、ACP的表达水平低于野生菌株。△vah1鳗弧菌菌株为后续减毒疫苗菌株或抗鳗弧菌特异性免疫增强剂制备奠定基础。     

水杨酸及其衍生物对溶菌酶光敏损伤的保护作用分析

利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）,研究了365Bin紫外照射引发蒽醌-2-磺酸钠（AQS）、溶菌酶（Lysozyme）和水杨酸及其衍生物（水杨醛、水杨酸甲酯）水溶液体系的光化学反应效应及影响因子．结果表明：AQS能够造成Lyso的光敏损伤,且损伤程度随AQS浓度增加及光照时间的延长而加剧;水杨酸及其衍生物对Lyso的光敏损伤具有显著的保护作用,其保护效果与水杨酸及其衍生物的浓度呈正相关;以抗坏血酸（Vc）作为对照,相同条件下,其保护效果依次为：水杨酸-水杨醛〉Vc〉水杨酸甲酯．     

马尾藻多糖对南美白对虾免疫调节作用

[目的]研究马尾藻多糖对南美白对虾免疫功能的影响。[方法]用含不同比例(0、0.10%、0.15%和0.20%)马尾藻多糖的虾饲料喂养对虾14 d,测定虾血淋巴液中溶菌酶、超氧化物歧化酶、酚氧化物酶和酸性磷酸酶的活性,计算攻毒感染后不同处理对虾存活率。[结果]含马尾藻多糖0.20%的虾饲料能极显著提高溶菌酶和酚氧化物酶活性,显著提高超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性和攻毒虾存活率,溶菌酶和酚氧化物酶含量分别达到(0.209±0.076)(、258.800±203.080)U/ml;含马尾藻多糖0.15%的虾饲料能极显著提高酚氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,显著提高溶菌酶活性和攻毒虾存活率,酚氧化物酶和超氧化物歧化酶含量分别达到(321.267±218.406)和(0.453±0.190)U/ml。[结论]马尾藻多糖能显著增强南美白对虾的免疫功能,其加入量为0.20%时效果最好。     

虾类蛋白质的双向电泳比较研究

试验以南美白对虾、刀额新对虾、罗氏沼虾为研究对象,利用单向SDS-PAGE凝胶电泳和双向电泳技术建立3种虾类的电泳图谱,建立分辨率高、重复性好的虾肉双向电泳图谱,并进行差异分析。结果表明：比较3种虾类蛋白图谱,发现具有统计学意义和分析意义的差异蛋白点共37个,其中15个蛋白点为南美白对虾的特征蛋白点,而刀额新对虾与罗氏沼虾的特征蛋白点分别为3个,7个。     

不结球白菜雌蕊蛋白质双向电泳技术体系的建立

以不结球白菜品种‘矮脚黄’的雌蕊为材料,从蛋白质提取、IEF程序、IPG胶条pH范围和染色方法等方面进行比较,利用Tris-HCl提取方法,使用pH 4～7 IPG胶条和改进的等电聚焦程序,改良银染方法,建立了适用于不结球白菜雌蕊蛋白质的双向电泳技术体系,并使用该体系对开花前2 d的花蕾雌蕊和开花2 d后的雌蕊蛋白质进行比较分析,获得187个差异蛋白点。     

鹿角杯形珊瑚溶菌酶PdLYZ重组蛋白的表达及其体外抑菌活性特征

珊瑚疾病的大规模爆发已严重威胁到珊瑚礁生态系统的结构和功能.溶菌酶是无脊椎动物固有免疫应答中的重要效应分子之一.本研究从鹿角杯形珊瑚(Pocillopora damicornis)中克隆得到了1个溶菌酶基因(PdLYZ),随后体外诱导表达并纯化PdLYZ重组蛋白,同时测定PdLYZ重组蛋白对大肠杆菌(Escherich...     

棉花种子蛋白多态性与品种鉴定方法的研究

蛋白分步提取电泳结果表明,棉花种子蛋白主要是以水溶性蛋白为主,盐溶性蛋白较少,醇溶性蛋白更少。因此,以蛋白质作为棉花品种的生化标记,应以水溶性蛋白为宜。AUGPAGE是一种新的棉花种子蛋白多态性研究方法,简单、快速、分离效果好。在凝胶溶液为10%丙烯酰胺、0.2%甲叉双丙烯酰胺、2%冰醋酸、10%尿素、0.05%甘氨酸的条件下,以2%冰醋酸为电极液,水、2.5%NaCl、50%异丙醇所提取的蛋白质均可得到良好的分离,以水溶性蛋白谱带最丰富、清晰,其多态性强,可作为棉花品种鉴定和种质资源研究的依据。     

鸡蛋清中3种蛋白质的连续化提取工艺初步研究

研究鸡蛋清中溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白的分离提取工艺.采用硫酸铵沉淀和离子交换层析分离3种蛋白质,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度.结果显示,层析纯化后SDS-PAGE检测其纯度达到电泳纯,溶菌酶的比活由144.13 U/mg提高到2 235 U/mg,纯化倍数达15倍,回收率为15.76％;卵转铁蛋白抑菌率为48.84％.该方法分离溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白的工艺路线简单、快捷、成本低,适用于工业生产.     

两种桃芽总RNA提取方法的比较研究

以‘曙光油桃’芽为试材,采用改良CTAB法、Trizol法进行总RNA提取,并通过凝胶电泳、核酸蛋白分析仪和Q-PCR检测所提取总RNA样品的质量。结果表明:改良CTAB法提取的RNA,经Q-PCR后扩增桃芽HK基因,可以得到与目的片段大小一致的条带,条带清晰,能满足基因表达分析等后续试验的要求;而Trizol法所提取的RNA,条带较弱,经Q-PCR后扩增桃树芽内HK基因,得不到与目的片段大小一致的条带,难以达到进一步试验的要求。     

3种菊酯类农药对南美白对虾同工酶表型的影响

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对注射不同浓度菊酯类农药的南美白对虾Penaeus vannamei3种组织的酯酶同工酶(EST)和苹果酸脱氢酶同工酶(MDH)进行了分析比较。结果表明：经农药胁迫后，虾体内各组织同工酶酶带出现明显的变化，在不同浓度下存在明显的差异，并具有明显的组织特异性。由于不同种农药的作用结合位点不同，使得酶带变化规律也不相同，当虾体被注射农药后，EST酶带变化较复杂，而MDH酶带则较稳定。当虾体受到农药胁迫时，可引起虾体无氧代谢加强，有氧代谢和酯类降解代谢减弱，正常的物质代谢平衡被破坏，因而使供给机体的能量减少，机体的免疫力和抵抗外界环境的能力均明显降低；另外，还有可能诱发虾病的暴发或导致虾的大批量死亡。     

鸡蛋清中3种蛋白质的连续化提取工艺初步研究

[目的]研究鸡蛋清中溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白的分离提取工艺。[方法]采用硫酸铵沉淀和离子交换层析分离三种蛋白质,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测其纯度。[结果]层析纯化后 SDS-PAGE检测其纯度达到电泳纯,溶菌酶的比活由144.13 U/mg提高到2235 U/mg,纯化倍数达15倍,回收率为15.76%;卵转铁蛋白抑菌率为48.84%。[结论]该方法分离溶菌酶、卵转铁蛋白和卵白蛋白,工艺路线简单、快捷、成本低,适用于工业生产。