苹果树腐烂病菌活性物质的提取分离及结构鉴定

为探索苹果树腐烂病菌(Valsa mali)野生型菌株03-8产生的活性物质及其与致病性的关系,在以蔗糖为碳源的MS液体培养基中25℃静置培养20d,利用大孔树脂吸附、二氯甲烷萃取、薄层层析和高效液相色谱等手段分离纯化,~1H-NMR、~(13)C-NMR、DEPT135、HMQC谱对纯化合物进行结构鉴定,并测定其生物活性。最终分离得到一个化合物D-2;结构鉴定为1-(3′-乙烯基-苯基)-1,2-乙二醇;该化合物1mg/mL的丙酮水[V(丙酮)∶V(水)=1∶4]溶液不能在烟草和苹果叶片上引起坏死斑,但对枯草芽孢杆菌有抑制作用。     

钾元素对苹果树腐烂病菌生长发育的影响

本研究在室内测试了不同浓度钾元素对苹果树腐烂病菌生长速率、菌丝形态、菌丝干重、分生孢子萌发及致病力的影响,旨在为寻找更有效的抗腐烂病菌靶标提供理论基础。在基础培养基PDA和PDB中分别添加不同量KCl粉剂,配制成含不同浓度钾的培养基,通过生长速率法、菌丝干重法、孢子萌发法和伤口接种法研究钾元素对腐烂病菌的影响。结果表明：纯钾浓度低于9.04 g/L时能促进腐烂病菌菌丝生长,当浓度高于9.04g/L时则抑制菌丝生长,同时,该浓度下的分生孢子孢子萌发率也出现显著下降。当纯钾浓度达到12.82 g/L时,腐烂病菌菌丝生长、孢子萌发和致病性都受到显著抑制;从19.16 g/L高浓度钾处理菌株接种的病果上分离获得的腐烂病菌菌株KVm470,其致病力与野生型Vm470相比显著下降。因此,树体中保持合理浓度的钾含量除了提高树体抗病性之外,还能够显著抑制腐烂病菌的侵染和扩展,而且,钾元素对腐烂病菌致病力的影响具有一定程度的可遗传性。     

甘肃省苹果树腐烂病菌ITS序列分析及潜育期研究

为了明确甘肃省苹果树腐烂病菌的种类及其优势种的潜育期,通过ITS序列比对和离体枝条接种法对采自甘肃省不同地区的苹果树腐烂病菌进行了ITS序列测定、分析及潜育期研究.结果表明:甘肃省苹果树腐烂病菌有2个种,分别为Valsa mali和Valsa malicola,其中Valsa mali有2个变种,分别为Valsa mali var.mali和Valsa mali var.pyri.甘肃省苹果树腐烂病菌优势种Valsa mali的潜育期随保湿时间增加而缩短,保湿时间为72h时潜育期为74.3h;温度30℃时潜育期最短,为64.3h;潜育期随枝龄的增加而增加,嫩梢的潜育期为46.3h;光暗交替下潜育期最短,为45.3h.     

苹果树腐烂病菌分生孢子产生条件研究

[目的]为了给生产实践中苹果树腐烂病研究提供一种获得分生孢子的方法。[方法]在室内测试苹果树腐烂病菌在6种培养基上的分生孢子产生条件,比较每种培养基上产生的分生孢子器个数、密度、大小、成熟率以及单个分生孢子器所含孢子数量等。[结果]PDA（添加马铃薯）、ABA（添加苹果树皮）培养基在各项参数对比中显著优于其他培养基。其中,PDA上产生的分生孢子器数量最多,ABA上产生的分生孢子器成熟率最高,产生成熟子实体的时间最短;黑光灯照射（紫外照度为53.5μW/cm2）有利于苹果树腐烂病菌分生孢子器的产生和成熟。[结论]提供了一种较为方便的室内获得苹果树腐烂病孢子的方法。     

环境因素对苹果树腐烂病菌分生孢子萌发与存活的影响

随着现代工业的发展,很多以前很少出现的细菌都萌生出来,在果树种植业中,苹果树腐烂现象近年来表现的越来越严重。正因如此,国内很多专家学者对此都进行了详细的研究,研究表明,苹果树腐烂主要是因为苹果树腐烂病菌的感染越来越严重,对此,通过对苹果树观察的经验以及对研究者研究结果的分析,找出了有关苹果树腐烂病菌分生孢子萌发和存活的环境影响因素。本文一开始对有关苹果树腐烂的研究进行分析,然后找到影响苹果树腐烂病菌分生孢子萌发和存活的影响环境因素。     

影响苹果树腐烂病菌侵染致病的流行因子

[目的]腐烂病是苹果树的重要枝干病害,主要造成死枝、死树.论文旨在明确低温等环境因子和枝条龄期等寄主因子对腐烂病菌(Valsa mali)侵染致病的影响,分析腐烂病流行成灾的原因,为腐烂病的流行预测和防控提供依据.[方法]通过人工控制环境条件下的接种试验,检测腐烂病菌在苹果枝干各部位的定殖率,观测腐烂病菌在伤口内的定殖...     

修剪工具对苹果树腐烂病菌的传播作用

为明确修剪工具能否传播苹果树腐烂病菌以及不同的修剪时间对苹果树腐烂病菌传播和侵染的影响,2011—2013年连续2个年度进行不同时间分别用带菌和不带菌修剪工具进行剪枝的试验。结果表明,带有腐烂病菌的修剪工具能够在修剪过程中传播苹果树腐烂病,并且与12月、1月、2月相比,选择在3月份进行集中修剪,发病率最低。     

苹果树腐烂病菌挥发性代谢物及其毒素活性

研究苹果树腐烂病菌代谢产生的挥发性物质及其毒素活性。通过在树皮培养基中培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,并利用苹果枝条对其标准物质进行毒素活性测定。结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生5种挥发性物质,分别为2-氟丙烯、异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚,其中异戊醇、2-苯乙醇、4-乙基苯酚、4-乙基-2-甲氧基苯酚均对苹果树枝具有毒素活性。苹果树腐烂病菌产生的挥发性代谢产物对苹果树具有毒素活性,为苹果树腐烂病菌致病机理的探索提供新的思路与方向。     

河北省苹果树腐烂病菌不同分离株生物学性状及致病性研究

为了明确河北省苹果树腐烂病病原菌的类型及致病性分化情况,从河北省8个苹果产区采集罹病样本,分离得到153株苹果树腐烂病菌,并根据菌落颜色、菌丝生长速率和疏密程度选取其中具有明显特征差异的12个代表性菌株进行了致病性测定.结果表明,河北省各地区苹果树腐烂病菌的菌落颜色分为7个类群,主要为浅黄色和黄色;不同分离株在菌丝生长速率和菌丝疏密程度上也存在较大差异,其中70.59％的菌株生长速率为中等,57.52％的菌株气生菌丝发达.不同颜色菌株的致病力有显著差异,在菌丝生长速率接近的情况下,浅黄色和黄白色菌株致病力较强;菌落颜色相同而菌丝生长速率不同的菌株间致病力也有显著差异,且致病力强弱与生长速率呈正相关;菌丝疏密程度对菌株致病力的影响不明显.以上试验结果均表明,河北省苹果树腐烂病病原菌具有多样性和致病性分化现象.     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体的筛选及Vmzfp3基因的功能分析

本研究采用接种离体枝条的方法,对150个苹果树腐烂病菌的T-DNA插入突变体库中的突变体进行了致病性的筛选,经过多次试验得到了3个致病力明显减弱的突变体,编号为X4379,X4368,X4468。基因组重测序结果显示,突变体X4379有2个T-DNA插入位点,分别是锌指蛋白3(Vmzfp3)和跨膜蛋白42(Vmtme42)。以苹果树腐烂病菌的全基因组序列为依托,设计引物,构建敲除载体以及互补表达载体。运用PEG的方法转化苹果树腐烂病菌,分别获得Vmzfp3和Vmtme42的敲除转化子和互补转化子。对Vmzfp3和Vmtme42基因敲除转化子、互补转化子以及野生型苹果树腐烂病菌菌丝形态和致病力进行分析。与野生型菌株03-8相比,Vmzfp3的敲除转化子的菌丝生长速率明显减慢,致病力也明显下降,其互补转化子使得这些功能缺陷均得以恢复。Vmtme42的敲除转化子无明显区别。由此证明基因Vmzfp3对病菌的菌丝生长,病菌的致病力具有调控作用。     

苹果腐烂病菌原生质体制备与再生条件优化

大量高质量且能再生的原生质体是真菌遗传转化、基因修饰的重要保证。本试验选用苹果腐烂病菌强致病力菌株SDAU11-175,从酶种类、菌丝年龄、酶解时间、渗透压稳定剂及再生培养基五个方面对原生质体制备及再生条件进行了优化。结果显示:获得苹果腐烂病菌原生质体最大产量的条件是菌丝年龄54 h、3%崩溃酶和3%裂解酶组合、0.7 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂、28℃酶解3 h,所得原生质体在YPS培养基上再生效果最好,再生率可达42.21%。     

苹果树腐烂病菌GTP-环化水解酶II基因敲除载体构建及其突变体的表型分析

【目的】利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体,通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能,为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础,并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。【方法】通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名）,该基因在接种5 d后,在病组织中表现出一定的上调表达,推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法,将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切,通过T4连接酶,将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上,转化到JM109菌株中,挑取阳性克隆,提取质粒,得到含有hph的Vmgtp1敲除载体,再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体,然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体,最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测,对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。【结果】通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体,并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化,共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株,经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证,得到1个敲除突变体,编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上,敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比,ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm?d-1,03-8平均生长速率为24.67 mm?d-1,突变体菌落生长速率明显变慢,颜色变浅,气生菌丝稀疏;ΔVmgtp1-90光照培养40 d仍无繁殖体的产生,而03-8光照条件下培养15 d后就能产生繁殖体,30 d后有分生孢子从繁殖体上溢出。致病性检测试验发现,接种ΔVmgtp1-90菌株7 d后,富士苹果枝条上病斑的平均直径为9.3 mm,与之相比,接种03-8的苹果枝条病斑平均直径为24.8 mm,ΔVmgtp1-90致病性显著减弱。【结论】通过基因敲除和遗传转化获得苹果树腐烂病菌中表达GTP环化水解酶II Vmgtp1的敲除突变体ΔVmgtp1-90,比较Vmgtp1突变体与野生型菌株的表型及致病性差异,发现Vmgtp1可能参与调控苹果树腐烂病菌菌丝生长和繁殖体的产生过程,并且可能在苹果树腐烂病菌致病过程中起作用,但是是否起主要作用还有待进一步研究。     

10种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌的室内活性评价

为筛选出对苹果树腐烂病防治高效的生物源杀菌剂,采用菌丝生长速率法、分生孢子萌发法和离体枝条接种法,测定了10种生物源杀菌剂对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果及其在苹果离体枝条上的保护作用。结果表明,10种供试生物源药剂对腐烂病菌均有一定的抑制效果,除3%中生菌素WP外,其他9种药剂对分生孢子萌发的抑制效果均优于对菌丝生长的抑制效果。其中,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP和复合微生物菌剂3种药剂的室内毒力最强,对菌丝生长和分生孢子萌发的EC₅₀分别为0.69、0.89、1.88、0.19、0.039μg·mL^-1和0.064μg·mL^-1。其次为0.5%氨基寡糖素AS、3%中生菌素WP、5%香芹酚AS、0.5%小檗碱AS和0.4%蛇床子素SL 5种药剂,对菌丝生长的EC₅₀为26.06～290.7μg·mL^-1,分生孢子萌发的EC₅₀为8.29～136.0μg·mL^-1。而0.3%苦参碱EC和2%农抗120AS对菌丝生长的EC₅₀均>2 000μg·mL^-1,显著>其他几种药剂,室内毒力最差。离体枝条保护试验结果表明,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP、0.5%氨基寡糖素AS和复合微生物菌剂对离体枝条保护作用最强,其室内防效均>85%,而0.3%苦参碱EC和2%农抗120AS保护作用最差,其室内防效与其他药剂之间存在显著差异,这与室内毒力测定结果相一致。综上所述,300亿·g^-1解淀粉芽孢杆菌WP、1 000亿·g^-1枯草芽孢杆菌WP、复合微生物菌剂和0.5%氨基寡糖素AS 4种药剂可作为防治苹果树腐烂病的替代生物源杀菌剂。     

苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

[目的]CAP(Cysteine-rich secretory protein,Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1)超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种,并且参与病原菌的致病过程.本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali)的C...     

2株不同地理来源的苹果树腐烂病菌对甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂的交互抗药性及生物适合度分析

测定2株不同地理来源的苹果树腐烂病菌对甾醇生物合成抑制剂（SBIs）类杀菌剂的交互抗药性及生物适合度,为SBIs类杀菌剂在苹果树腐烂病的防控上提供理论依据。采用菌丝生长速率法分别测定2株不同地理来源的苹果树腐烂病菌对3种甾醇生物合成抑制剂类杀菌剂和1种苯并咪唑类杀菌剂的交互抗药性,通过繁殖体数量测定法、生物量测定法、离体枝条接种法测定其生物适合度。结果表明,2株病菌（VM09和VM01）对SBIs类杀菌剂苯醚甲环唑、戊唑醇、抑霉唑的敏感性存在显著差异,苯醚甲环唑、戊唑醇、抑霉唑对VM09的EC₅₀值分别是VM01的10.49、9.03、79.09倍,表明腐烂病菌对检测药剂存在正交互抗药性;而对苯并咪唑类杀菌剂甲基硫菌灵无显著差异,不存在交互抗性。对2株病菌的生物适合度分析发现,其生长速率、繁殖体数量、菌丝干重以及对NaCl的渗透敏感性均存在显著差异,但致病力无显著差异。苹果树腐烂病菌菌株VM09对SBIs类杀菌剂存在正交互抗药性,且对SBIs类杀菌剂敏感性降低的菌株的生物适合度发生了明显变化,在一定程度上增加了其适生性。     

多效灵防治苹果树腐烂病试验

本试验对多效灵防治苹果树腐烂病进行研究．试验结果表明：多效灵５０倍液当年防效为１００％，次年防效为９０．１％；多效灵１００倍液当年防效为８３．５％，次年防效为７９．９％。均显著高于福美砷的防治效果。     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。