甘蓝型油菜烷羟化酶基因MAH1的克隆与表达分析

在植物蜡质合成途径中,中链烷烃羟化酶(mid-chain alkane hydroxylase,MAH)催化烷烃羟基化形成二级醇,进一步氧化为酮。本研究以拟南芥P450依赖性酶CYP96A15/MAH1基因为探针,采用电子克隆与RT-PCR技术,获得2个甘蓝型油菜MAH1的全长编码区序列,分别命名为BnMAH1-1和BnMAH1-2(Gen Bank登录号分别为KT795344和KT795345)。二者ORF长度均为1491 bp,无内含子,核苷酸与氨基酸序列分别有92.4%与90.9%的一致性。根据编码区预测的BnMAH1-1和BnMAH1-2前体蛋白均为包含496个氨基酸残基的多肽链,具有典型的P450蛋白家族保守结构P415x R417x、K螺旋(E359xx R362)、C末端的血红素结合域(F436xx Gx Rx Cx G445)以及氧结合带保守区域(A/G)G309x(D/E)T312(T/S)。NCBI Blast N、氨基酸序列多重比对与系统学分析表明,两者与拟南芥MAH1/CYP96A15同源性最高。实时荧光定量PCR表明,BnMAH1-1与BnMAH1-2主要在甘蓝型油菜茎、叶、花、及角果中表达,其中在叶片中的表达量最高,在根系中的表达量很低,这与角质层蜡质主要沉积在植株地上部分相一致。BnMAH1-1和BnMAH1-2在无蜡粉材料茎、叶片中几乎不表达,表明蜡质的减少与MAH1的转录下调有关。BnMAH1-1与BnMAH1-2受SA、Me JA、ACC、ABA、Na Cl及干旱胁迫诱导表达,其中BnMAH1-1可能在水分胁迫响应中起主要作用。     

甘蓝型油菜LPAT4基因的克隆与表达

植物溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophospholipid acid actyltransferase, LPAT)是三酰甘油生物合成过程中的一个关键酶, 在脂质的合成、种子的发育以及生物膜的流动性等方面有重要作用。本研究采用同源克隆的方法, 获得LPAT4基因的2条全长CDS序列, 长度分别为1143 bp和1140 bp。生物信息学分析表明, 它们均具有LPLAT_LCLAT1样结构域, 同属于LPLAT超基因家族, 并分别被命名为BnLPAT4-1和BnLPAT4-2。时空表达分析表明, 它们均为组成型表达基因, 其中BnPAT4-1在叶中的表达量最高, 而BnPAT4-2在胚中的表达量最高。逆境分析表明, BnLPAT4-1和BnLPAT4-2在NaCl、PEG-4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现出不同的表达模式。极差分析显示, ABA对BnLPAT4-1的表达影响较大, 而BnLPAT4-2的表达却对PEG4000更敏感。为进一步研究油菜BnLPAT4基因功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与表达分析

植物防御素具有广谱抗菌活性,不仅具有抗真菌、抗细菌、蛋白酶抑制和昆虫淀粉酶抑制等活性,而且参与调节植物的生长和发育。本研究根据白菜防御素基因序列设计引物,从甘蓝型油菜中克隆获得5个防御素基因,其c DNA全长325~461 bp,含有177~243 bp开放阅读框,编码58~80个氨基酸,含有8个保守Cys残基,具备Knot1功能域。系统进化分析表明,Bn PDF2.1、Bn PDF2.3、Bn PDF2.5与拟南芥PDF2亲缘关系较近,可能具有蛋白酶抑制活性。荧光定量分析表明,防御素基因具有组织表达特异性,在花蕾和叶中表达量较高,角果中次之;经1 mmol L–1水杨酸处理开花期油菜2 h后,防御素基因在茎、花蕾、角果中的表达量均有不同程度的上调,但在叶中表达有所下调,在根中表达无明显变化。     

甘蓝型油菜BnAPX1基因的克隆与生物信息学分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种利用抗坏血酸作为电子供体的H₂O₂清除剂,在植物抵御逆境胁迫中起到重要作用。为进一步探究甘蓝型油菜APX1基因的功能,本研究通过RT-PCR法从甘蓝型油菜中克隆得到一条长度为753 bp的APX1 CDS序列,将其命名为BnAPX1。生物信息学分析表明,BnAPX1基因共编码250个氨基酸,相对分子量为27.546 14 kD,等电点为5.49,不稳定系数为36.73,属于稳定性蛋白;该蛋白的二级结构中无规则卷曲为42.00%,α-螺旋为39.20%,延伸链为10.40%,β-转角为8.40%;亚细胞定位预测结果显示该基因编码的蛋白位于过氧化物酶体中,其编码的蛋白没有跨膜结构,没有信号肽,属于非分泌蛋白。BnAPX1蛋白含有K+binding site、Substrate binding site、Heme binding site结合位点,属于植物过氧化物酶类似家族。     

甘蓝型油菜BnaFIL基因启动子的克隆与表达分析

为了进一步了解启动子在甘蓝型油菜FIL基因(BnaFIL)表达调控中的作用,根据甘蓝型油菜基因组数据,以甘蓝型油菜叶片提取的DNA为模板,对甘蓝型油菜BnaFIL基因的启动子序列pBnaFIL进行克隆,长度为1 326 bp。采用PlantCARE在线分析软件对该启动子序列进行生物信息学序列分析,结果表明,该序列含有参与光反应的部分保守DNA模块以及CAAT-box和TATA-box等核心启动子必备元件,与分生组织表达有关的顺式作用的调控元件CAT-box以及光敏反应元件。通过该启动子序列替换pBI121植物表达载体上的CaMV35S启动子,使该启动子与GUS基因融合获得pBnaFIL-GUS表达载体,将载体通过农杆菌花序浸染的方法转入拟南芥中,获得了早花启动子重组质粒阳性转基因株系和晚花启动子重组质粒阳性转基因株系。之后对转基因拟南芥植株进行GUS染色分析,对启动子的表达效果进行了检测,最终在不同的转基因拟南芥植株中均发现了GUS基因的表达。结果表明,早花材料与晚花材料中启动子表达强弱存在差异,早花材料启动子的驱动基因表达效果比晚花材料启动子的驱动效果要好,由此推断,启动子的驱动效果...     

甘蓝型油菜BnFAD2基因的克隆、表达及功能分析

高油酸油具备较高的营养价值,在甘蓝型油菜中,脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制油酸含量的关键基因。本研究克隆了甘蓝型油菜A5、C5、A1连锁群上3个BnFAD2基因的全长cDNA序列,分别命名为BnFAD2-A5、BnFAD2-C5和BnFAD2-A1,各自编码384、384、136个氨基酸。分别使用TMHMM、Clust X软件分析FAD2基因的跨膜结构域和酶活中心表明,BnFAD2-A1不具备脱氢酶活性。采用酵母功能互补实验对4个基因(含已发表的BnFAD2-C1)进行功能验证,发现BnFAD2-A5和BnFAD2-C5基因去饱和能力接近,均大于BnFAD2-C1基因。采用qRT-PCR分析4个基因在甘蓝型油菜不同组织中的表达规律及血凝素标签法分析BnFAD2-C1、BnFAD2-A5和BnFAD2-C5的蛋白稳定性,表明BnFAD2-A5和BnFAD2-C5是影响油菜种子油酸积累的主效基因。     

BnMAPK2对甘蓝型油菜耐旱性的影响

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)级联参与植物多种生物及非生物胁迫应答过程,BnMAPK2属于MAPK级联途径最下游C族基因。本研究成功获得BnMAPK2超量表达(OE-MAPK2)和RNA干扰表达(RNAi-MAPK2)转基因甘蓝型油菜,在干旱条件下, OE-MAPK2植株耐旱性增加, RNAi-MAPK2植株耐旱性降低。相关生理指标试验结果证明,在干旱胁迫下,BnMAPK2可减缓叶片脱水程度、促进植物体内脯氨酸积累、降低丙二醛含量,在干旱后期增加POD活性。比较干旱相关基因(P5CSB、SCE1)、BnMAPK2互作干旱相关基因(STRS2、CRL1)以及STRS2依赖ABA信号途径相关基因(RD22、MYC、SnRK2),在转基因植株和野生型植株中表达水平变化差异,结果表明, BnMAPK2可正向调控P5CSB、SCE1、CRL1、RD22、MYC、SnRK2的表达;负调控STRS2的表达,并且STRS2依赖ABA信号途径相关基因在OE-MAPK2植株中的表达变化趋势和strs2突变体中一致。由此推测BnMAPK2可通过...     

甘蓝型油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)的克隆与真核表达载体的构建

根据已知的拟南芥甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH1)序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆出油菜甜菜碱醛脱氢酶基因(BnBADH-1)全长。测序和分析结果表明,BnBADH-1的cDNA全长1506bp,编码一个包含501个氨基酸残基、分子量为55kD、等电点(pI)为5.16的假定蛋白质;核酸序列和氨基酸序列与拟南芥的同源性分别为90.24%和93.41%。利用片段两端的粘性末端酶切位点BamHⅠ和SacⅠ将cDNA片段连接在真核表达载体pBI121上;PCR鉴定表明,过量表达载体pBI121-BnBADH-1已成功构建,为下一步的基因功能分析做好了准备。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

甘蓝型油菜 LPAT5基因克隆与表达分析

克隆并对溶血磷脂酸酰基转移酶时空表达和逆境表达进行分析,旨在为进一步研究其生物学功能奠定基础。结合同源克隆与半定量RT-PCR的方法,克隆得到甘蓝型油菜湘油15 LPAT5的1条全长1041 bp 的CDs序列,并命名为BnLPAT5。序列分析表明,它具有LPLAT_LCLAT1样结构域,属于LPLAT超基因家族。时空表达分析表明, BnLPAT5在根中的表达量最高,是茎和胚的2倍。逆境分析表明,BnLPAT5在NaCl、PEG4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现2种不同的表达模式,他们均对BnLPAT5基因的表达具有抑制作用。在NaCl、PEG4000及水渍处理下,BnL-PAT5呈“骤降缓升”的表达模式,处理3 h时,达到最低表达量。对于6BA和ABA的处理,BnLPAT5却呈现“缓降缓升”的表达模式,处理12 h时,表达量最低。极差分析显示,高盐、干旱、水渍、6BA和ABA对BnLPA5基因的表达影响程度相当,相对而言,高盐对其表达的影响较大。试验首次从甘蓝型油菜中克隆得到LPAT5的1个拷贝,并分析了其时空表达和逆境表达,认为所得基因为普遍表达基因,并对干旱比较敏感。     

甘蓝型油菜MAPK7基因家族及其启动子的克隆与表达分析

从甘蓝型油菜中克隆了MAPK7基因家族3个成员BnMAPK7-1、BnMAPK7-2和BnMAPK7-3的全长cDNA序列,它们最长标准mRNA分别为1593、1434和1547 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK7基因全部来自白菜,而且BnMAPK7-1/-2的是由白菜Bra03723祖先基因加倍产生的,而BnMAPK7-3则由白菜中Bra037234的祖先基因进化形成的。同时,克隆获得BnMAPK7-1/-2的启动子序列,该启动子里含有多个与光诱导相关的元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)显示甘蓝型油菜MAPK7基因家族在所有的组织器官中均表达,并发现该基因家族的表达受植物激素(MeJA、ABA、SA)、信号分子(H₂O₂)、逆境(高温)以及伤害(损伤和核盘菌)的诱导,初步证明甘蓝型油菜MAPK7基因在植物逆境胁迫应答中起一定作用。实现了甘蓝型油菜MAPK7-1/-3基因的原核表达,并证明它们编码的蛋白主要以包涵体形式存在,为后续的研究提供了基础。     

种子特异表达启动子的克隆分析及其植物表达载体的构建

根据GenBank已公布的种子特异性的Oleosin蛋白基因启动子序列设计合成引物,利用PCR技术从油菜总基因组DNA中扩增出Oleosin基因启动子序列(SOP),将该序列克隆到pGM-T载体中,经鉴定获得pGM-T-SOP重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由899 bp核苷酸组成,其核苷酸序列与GenBank中的Oleosin基因启动子序列同源性高达95.6%。分别用限制性内切酶HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pGMT-SOP和双元植物表达载体pBI121,分别回收pGMT-SOP重组质粒中的SOP小片段和pBI121植物表达载体中去掉CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定,获得由SOP驱动报告基因GUS的新型植物表达载体pBI121-SOP,为外源基因在油菜种子中的定位表达研究奠定基础。     

甘蓝型油菜SLG基因片段的克隆及序列分析

通过不同甘蓝型油菜中SLG基因的克隆及序列分析, 探索了甘蓝型油菜中是否存在与芸薹属二倍体中相同或相似的S-locus基因。对10个甘蓝型油菜品种和品系中SLG基因的PCR扩增和序列比较分析发现, 这些甘蓝型油菜中都存在第2类的SLG基因, 而且, 同二倍体芸薹属物种一样, 第2类SLG基因之间具有较高的同源性; 只有5个甘蓝型油菜品种和品系中存在第一类SLG基因, 而且这些基因序列之间表现出高度的保守性, 即同源性在96%以上, 明显高于不同等位基因之间的同源性。这些甘蓝型油菜中的class I SLG基因可能源于同一个自交不亲和单体。     

甘蓝型油菜BnFAD2-C1基因全长序列的克隆、表达及转录调控元件分析

脂肪酸去饱和酶基因(FAD2)是控制植物体中油酸含量的关键基因,在甘蓝型油菜中有4个FAD2基因的拷贝,分别定位在A1、C1、A5、C5染色体上。本文克隆了1个FAD2拷贝基因,依据油菜基因组数据库信息,将其定位到C1染色体上,命名为Bn FAD2-C1,其开放阅读框为1155 bp。采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)技术获得了175 bp的5?UTR序列和212 bp的3?UTR序列。采用荧光定量PCR技术研究发现,Bn FAD2-C1在根、花和角果皮中仅保持本底水平的表达,在种子发育中期呈现高效表达,具有种子特异性诱导表达的特征。根据甘蓝和油菜基因组数据库信息,同源克隆到Bn FAD2-C1基因的启动子(promoter)和内含子(intron)序列,并通过PLACE和Plant CARE网站分析,初步预测到调控该基因转录的潜在顺式作用元件。通过茉莉酸诱导处理,Bn FAD2-C1基因表达量发生变化,推断茉莉酸在Bn FAD2-C1基因的表达过程中可能发挥一定的调控作用。     

甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因BnECR的克隆及功能分析

反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2, 3-enoyl-CoA reductase, ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥等的ECR基因设计引物,采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR的全长cDNA序列和对应的基因组序列,命名为BnECR (GenBank登录号分别为FJ899705和FJ899706)。序列分析结果显示,BnECR的全长cDNA序列为1 328 bp,对应的基因组序列为2 093 bp,由4个外显子组成,在ORF的上、下游分别有一个163 bp的5′UTR和一个232 bp的3′UTR。根据编码区预测BnECR前体蛋白为一个310个氨基酸残基的多肽链,包含ECR蛋白的重要功能位点K₁₄₄、R₁₄₅及一个NAD(P)H结合基序G₂₂₅SGGYQIPR/HG₂₃₄。NCBI Blastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明, 该基因与拟南芥AtECR基因的同源性最高,是对应拟南芥AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明,BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达,其中在茎中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子,表明BnECR可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。将BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中,分别转化野生型酵母By4743和突变体菌株YDL015c,添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明,BnECR在酿酒酵母中有效表达,转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%,比对照增加了52%;对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。