胶孢炭疽菌CgHYD1影响分生孢子的疏水性和对橡胶树的致病性

橡胶树胶孢炭疽菌是橡胶树的重要致病真菌之一。本研究利用RT-PCR技术克隆了一个候选目的蛋白基因,命名为CgHYD1。生物信息学分析表明,该基因的开放阅读框为294个碱基对,编码一个含有97个氨基酸的蛋白。该蛋白含α螺旋结构和一个Hydrophobin-2疏水蛋白结构域,且该结构域中的第三与第四个半胱氨酸残基之间间隔11个氨基酸,符合Ⅱ类疏水蛋白的结构特征。系统进化树分析结果表明CgHYD1位于Ⅱ类疏水蛋白分支。根据同源重组的原理和真菌原生质体转化方法构建了该基因的敲除突变体ΔCgHYD1以研究该基因的生物学的功能。表型分析结果表明,ΔCgHYD1分生孢子表面的疏水性明显小于野生型,ΔCgHYD1对橡胶树叶片产生的致病性明显比野生型菌株(WT)强。以上结果表明,橡胶树胶孢炭疽菌CgHYD1基因与胶孢炭疽菌分生孢子的疏水性强弱有关,并在炭疽菌致病过程发挥作用。结果为进一步研究CgHYD1在橡胶树致病性与分生孢子疏水性之间的关系提供理论参考,为橡胶树在分子抗病提供理论支持。     

胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi突变体获得与功能分析

为了研究胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的功能以及与致病相关基因间的关联性。利用RNAi技术构建沉默载体pSilent-1:CgUBC2,通过PEG介导法获得突变体菌株,实时荧光定量PCR法分析其侵染寄主过程中的差异表达,以及与PG、ECH、LIP、PKS、HMT、Sin3P、NRPS 7个致病相关基因的关联性。通过特异性引物检测鉴定、表达量分析,获得CgUBC2的RNAi突变体为pSilent-1:CgUBC2-1和pSilent-1:CgUBC2-2,侵染过程中突变体菌株CgUBC2基因表达量、7个致病相关基因的表达量显著低于野生型菌株。成功获得胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突变体,CgUBC2参与侵染寄主的过程、正向调控7个致病相关基因和致病力。     

橡胶树胶孢炭疽菌效应蛋白基因CgE35对孢子产量的影响

橡胶树炭疽病是橡胶树的重要真菌病害之一,主要由胶孢炭疽菌引起。效应蛋白是病原菌侵染植物的重要致病因子,在寄主与病原菌的相互识别中发挥重要作用。为了进一步阐明橡胶树炭疽菌的致病机理,课题组前期对橡胶树胶孢炭疽菌的效应蛋白在基因组水平上进行了预测,其中一个编码候选效应蛋白的基因被命名为CgE35。本研究对CgE35基因进行了扩增,并对其所编码的效应蛋白CgE35进行了生物信息学的分析,分析结果表明,该基因编码一条由200个氨基酸组成的多肽,分子质量约为21.7 kD,其氨基段含有一段由24个氨基酸组成的典型信号肽序列,且该蛋白不含任何跨膜结构域和已知的保守结构域。为了进一步研究该基因的功能,我们根据同源重组原理,构建了 CgE35基因的敲除载体pCB1532-CgE35,通过PEG介导的原生质体转化法将其转入胶孢炭疽菌原生质体细胞中进行同源交换,经过对转化子进行抗性筛选和分子鉴定,获得CgE35基因的敲除突变体ACgE35,并对其孢子产量和菌落生长情况进行分析,发现胶孢炭疽菌CgE35基因的敲除突变体ACgE35的孢子产量明显低于野生型菌株,而二者的菌落生长情况没有差异。以上结果表明,橡胶树胶孢炭疽菌CgE35基因编码一个未知功能的分泌蛋白,该基因与胶孢炭疽菌的产孢能力有关,但与其菌丝的生长关系不大。本研究结果为阐明胶孢炭疽菌的致病机理,建立新型橡胶树炭疽病防控策略提供理论依据。     

杧果叶片响应胶孢炭疽病菌侵染的转录组分析

为探讨杧果抵御胶孢炭疽病菌的分子机制,分别以感病和未感病的‘贵妃杧’叶片为材料开展转录组测定和分析。本研究以‘贵妃杧’幼嫩叶片为材料,胶孢炭疽菌接种杧果叶片24 h后,转录组分析(RNA-seq)感病和未感病叶片之间的基因表达差异,共得到序列46 733个,110个差异表达基因中,67个基因表达为上调,43个基因表达为下调。利用GO数据库对差异表达基因进行聚类分析,发现差异表达基因主要聚类在细胞及细胞组分、代谢过程、催化活性等方面。利用KEGG数据库对差异表达基因影响的通路进行注释后发现,胶孢炭疽菌侵染主要影响了牛磺酸和牛磺酸代谢、淀粉、蔗糖代谢等途径中关键基因的表达水平。Autophagy-related protein 8C-like等11个基因的RT-qPCR验证与RNA-seq数据一致,且这些基因在6、12、24 h均能迅速响应胶孢炭疽菌的侵染。另外,三羧酸循环(TCA)过程中琥珀酸脱氢酶的4个亚基也参与了胶孢炭疽菌侵染杧果的过程。本研究从转录组水平上分析了杧果响应胶孢炭疽菌侵染过程中的一些关键基因,也从胶孢炭疽菌的角度分析了琥珀酸脱氢酶4个亚基参与了胶孢炭疽菌的侵染过程,有助...     

枯草芽孢杆菌Bs01发酵条件的优化及对胶孢炭疽菌的抑制

Bs01是前期研究分离的一株对果实胶孢炭疽菌具有较强抑制作用的枯草芽孢杆菌菌株。本研究以其发酵后的发酵液上清对胶孢炭疽菌的离体抑菌活性为评价指标,优化了Bs01发酵培养基的氮源、碳源和无机盐成分及配比,同时采用正交试验优化了发酵时间、起始pH、接种量、装液量及温度等发酵条件,并对比测定了最佳发酵条件获得的发酵液上清对胶孢炭疽菌的抑制效果。结果表明,可获得具最强离体抑菌活性发酵液上清的发酵培养基最优氮源、碳源及无机盐分别为细菌蛋白胨、葡萄糖和NaCl,最佳的发酵培养基配方为:2%葡萄糖、3%细菌蛋白胨和0.5%NaCl。最佳的发酵条件组合是:起始培养基pH为7.0,接种量15%,装液量1/10,32℃、200 r/min振荡培养48 h。采用优化后的最佳发酵培养基及发酵条件组合获得的发酵液上清可显著抑制活体接种的胶孢炭疽菌病斑扩展,降低病情指数,显著优于优化前获得的发酵液上清的抑制效果。     

BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性

类萌发素蛋白(germin-like protein, GLP)是一类含有cupins结构域的糖蛋白, 在植物基础抗性等方面起着重要作用。本研究人工合成了甜菜GLP基因BvGLP1, 并利用基因重组技术构建了受韧皮部特异表达启动子RSS1P驱动的BvGLP1基因单子叶植物表达载体pA20-RSS1P::BvGLP1。通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中, 对转基因扬麦18的T₀至T₃代植株中BvGLP1进行了PCR、半定量RT-PCR和荧光定量QPCR检测, 并对转基因小麦进行根腐病和纹枯病抗性鉴定。结果表明, BvGLP1已转入转基因小麦扬麦18, 并能在转基因小麦中遗传、转录表达; 5个转BvGLP1基因小麦株系的根腐病抗性比受体品种扬麦18有显著提高, 说明BvGLP1过表达增强了转基因小麦对根腐病的抗性。     

异源过表达Atvip1基因增强转基因高粱对盐碱胁迫的抗性

为了研究异源过表达Atvip1基因的高粱对盐碱胁迫的耐受性及相应生长情况,采用NaHCO_3∶Na_2CO_(3 )为5∶1,75 mmol/L,pH值9.63的盐碱胁迫液在高粱三叶一心期处理,在胁迫0,4,12,24,72,120 h对根系的生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性以及MDA含量进行测定。结果表明:异源过表达Atvip1基因能缓解盐碱胁迫对高粱幼苗生长的伤害,可使幼苗根表面积和根体积增大,根尖数和分叉数增多,高粱主根褐化出现较晚且症状轻,侧根发生早且数量多,在72 h后仍能保证新叶正常伸展,对地上部生长影响较轻。过表达Atvip1基因可提高转基因高粱根系抗O_2~(-·)活力,降低MDA的含量,抗氧化酶活性增强;胁迫早期(4～12 h),SOD、CAT和GR作用明显;胁迫中期(24～72 h),所有酶均发挥作用;胁迫后期(120 h),CAT和GSH-PX起重要作用。盐碱胁迫差异转录组分析中,差异表达基因COG分析表明,防御机制在不同时间段中占比较大,获得抗氧化酶相关差异表达基因42个。异源过表达Atvip1基因可通过缓解盐碱胁迫对光合作用和生长发育的影响,降低活性氧破坏及膜损伤来提高转基因高粱对盐碱胁迫的抗性。     

转录因子基因TaWRKY72b-1的克隆，表达及在烟草中表达对植株磷效率的影响

在富集低磷胁迫特异表达基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中,鉴定了1个与拟南芥WRKY75同源的小麦WRKY型转录因子基因表达序列标签(EST)。依据该EST序列高度同源的小麦WRKY72b序列,克隆了对应基因TaWRKY72b-1。TaWRKY72b-1与WRKY72b在cDNA序列上有2个碱基的差异,但编码氨基酸没有改变。TaWRKY72b-1开放阅读框为621 bp,编码206个氨基酸残基,氨基酸组成上含有保守的WRKY基序和C2H2基序。系统进化分析表明,TaWRKY72b-1与小麦WRKY72a和大麦WRKY12可能来自相同的祖先。与对照供磷水平(2 mmol L^-1 P)相比,低磷处理使根叶中TaWRKY72b-1的转录本数量均明显增多。表明TaWRKY72b-1对低磷胁迫逆境产生了明显的应答作用。TaWRKY72b-1在烟草中表达表明,低磷胁迫条件下,高表达TaWRKY72b-1的烟草植株干重、单株磷累积量和磷利用效率均较对照明显增加。因此,TaWRKY72b-1基因在改善低磷胁迫下作物的磷效率中可能具有较重要的应用价值。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应

谷子白发病是谷子生产上的重要病害,可严重影响谷子的产量和品质。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病,生长发育等多种生理过程。为了探究谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应,进而发掘谷子特有的抗病基因并为以后的抗病研究提供参考,本研究以感病品种‘晋谷21’为试材,基于前期对转录组测序的基础上,筛选出8个与谷子白发病相关的WRKY转录因子基因,然后通过生物信息学技术,对这8个WRKY转录因子基因特征,基因序列及所在染色体位置,基因组结构模式启动子序列元件,与白发病菌相关的调控元件以及表达模式等进行了分析。研究发现,8个WRKY转录因子基因中5个基因分布在5号染色体上,在受白发病菌胁迫后其表达水平存在显著差异。启动子顺式元件分析的组成和分布也存在较大差异,8个基因的蛋白大小是202~440个氨基酸,系统进化树分析表明,基因Seita.8G123100,Seita.5G261700的亲缘关系较近,并且受侵染后的表达水平均高于正常水平。发现8个基因中5个基因在受到病原菌侵染时其表达水平高于其正常状态下的基因表达水平,可以作为谷子抗病的重要候选基因。本研究结果为后续筛选谷子抗病基因及谷子抗病机制的研究奠定了一定的理论基础。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

三七NAC转录因子基因PnNAC1的克隆及表达特性分析

为了揭示三七抗病防卫反应的调控机制,对三七的一个NAC转录因子的全长cDNA进行了克隆和表达特性分析。以一年生三七幼苗为材料,根据编码NAC转录因子的三七转录组Unigene设计引物,采用快速扩增cDNA末端技术,克隆得到一个新的NAC转录因子基因,命名为PnNAC1。序列分析表明,该基因全长815 bp,含有24 bp的5'非翻译区和215 bp的3'非翻译区,以及576 bp开放阅读框,共编码191个氨基酸,具有保守的NAC结构域。实时荧光定量PCR结果显示茉莉酸甲酯预处理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的转录水平,接种茄腐镰刀菌后,PnNAC1的表达进一步上升,在接种后4 h转录水平达最大值;无菌水预处理的三七中,PnNAC1也快速响应茄腐镰刀菌的侵染,但表达水平明显低于茉莉酸甲酯预处理的样品。接种人参链格孢后PnNAC1在叶片的表达量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸和过氧化氢4种信号分子处理三七根部均诱导PnNAC1的表达。表明PnNAC1响应几种逆境相关信号分子,并参与三七对茄腐镰刀菌和人参链格孢的防卫反应。     

小麦TaPIM1基因的克隆及其转基因烟草的抗病性分析

TaPIM1是从小麦中克隆获得的1个病原诱导的小麦MYB基因,编码由323个氨基酸残基组成的蛋白TaPIM1。TaPIM1具有R2R3类MYB转录因子的典型结构,即2个保守的MYBDNA结合域(R2和R3)、核定位位点和酸性激活区。TaPIM1的全长氨基酸序列与已克隆MYB蛋白的一致性仅为43.69%以下,为植物MYB转录因子家族R2R3亚群的一个新成员。小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)侵染可快速诱导抗病小麦中TaPIM1基因的上调表达,说明TaPIM1可能参与小麦对纹枯病菌、根腐病菌的防御反应。将TaPIM1基因构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的双子叶转化载体pBI121上,通过农杆菌介导法将其转入烟草W38品系。通过卡那霉素抗性筛选和PCR检测,鉴定出转TaPIM1基因烟草T0代株系M66、M102、M110等12个株系。对转基因烟草T1代株系进行PCR、RT-PCR分析和青枯病菌抗性分析,结果表明,TaPIM1超量表达的转基因烟草株系M66、M102和M110对青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的抗性显著高于未转基因烟草对照,TaPIM1正向调控烟草对某些病原菌的防御反应。     

薤白EPSP合成酶基因转化烟草提高其草甘膦抗性

葱属植物薤白具有较强的草甘膦抗性.将薤白中与草甘膦抗性相关的EPSP合成酶基因(EPSPsA)cDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建薤白植物表达EPSPsA重组载体,采用根癌农杆菌介导法将其转入烟草品种WS38,获得转薤白EPSPsA基因烟草.PCR分析表明,目的基因已经整合进烟草基因组中.对转基因烟草愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因烟草对草甘膦的耐受性明显提高.     

条锈菌诱导的小麦bZIP转录因子基因的克隆及表达分析

采用电子克隆和RT-PCR方法,从条锈菌诱导的小麦品种水源11的cDNA中分离到一个编码bZIP转录因子基因的cDNA序列,暂被命名为TabZIP。TabZIP包含一个完整的1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域;与水稻、玉米、拟南芥等植物bZIP蛋白的氨基酸序列相似性较高;TabZIP基因在小麦根中的表达量丰富,而在茎和叶中表达量很小;在小麦与条锈菌非亲和组合中,TabZIP基因高水平表达,而在亲和组合中没有明显的变化;防卫相关激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因的快速上调表达,表明TabZIP可能通过乙烯、茉莉酸信号途径介导小麦对条锈病的防御反应。     

转录因子OsHOX4过量表达及T1代转基因植株中纯合系鉴定

OsHOX4基因是属于水稻植物同源结构域(HD-Zip)转录因子家族的一个成员。本研究利用农杆菌介导法将OsHOX4基因转入籼稻(Oryza sativa ssp.indica)IR64中,获得54株过量表达植株。我们利用southern杂交分析确定了各个株系的拷贝数后,利用TAIL-PCR方法对4个不同的单拷贝株系进行了研究,并在其中找出T-DNA在3个单拷贝株系染色体上的插入位点(分别为染色体5,8,10)。根据T-DNA在各个株系的插入位点分别设计特异性引物,从T1代转基因株系里鉴定出纯合的植株。我们观察到OsHOX4过量表达植株的分蘖数明显高于野生型,株高比野生型明显的变矮,在同一个株系的纯合和杂合的转基因植株表型也有很大的差异。在TAIL-PCR分析基础上,为从T1代转基因作物中鉴定出纯合的植株提供了方法和理论依据。