小反刍兽疫N5蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立一种适用于PPRVN蛋白抗体的间接ELISA检测方法,应用于PPR防疫.【方法】根据GenBank中登录小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria 75/1株N基因序列进行人工合成,设计1对特异引物对N5基因扩增,经测序分析后将N5基因片段和原核表达载体pET-32a(+)相连接,成功构建pET-32a-N5质粒.将pET-32a-N5转化于TransB(DE3)原核表达感受态细胞后用IPTG诱导表达获得重组蛋白,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,重组蛋白分析具有良好的反应原性.【结果】利用原核表达纯化的PPRV N重组蛋白作为包被抗原,初步建立了一种能够检测针对PPRV N蛋白抗体的间接ELISA方法.用建立的方法对112山羊份血清进行了抗体检测,该方法与竞争ELISA试剂盒对比,临床符合率94.8%.【结论】该方法具有较好的敏感性、重复性和特异性.     

羊伪结核抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】建立羊伪结核棒状杆菌抗体的间接ELISA检测方法。【方法】分别用不同浓度的伪结核棒状杆菌菌体抗原和培养上清可溶性抗原包被酶标板,用脱脂奶粉封闭酶标板,设置封闭时间分别为1.0,1.5和2h,再用不同稀释度的血清(1∶100,1∶200,1∶400和1∶800)与之反应,以此优化间接ELISA反应条件,确定阳性结果判定的临界值。对间接ELISA方法的特异性和重复性进行考察,并在此基础上对采集的临床样本进行检测。【结果】选用伪结核棒状杆菌菌体为包被抗原,最佳包被抗原菌体密度为OD600=0.08,血清的最佳稀释度为1∶400,封闭时间为2h,阳性血清的临界值为0.329。该抗体检测方法可特异性地检测出伪结核阳性血清,羊口疮阳性血清、羊痘阳性血清、乳房炎阳性血清均呈阴性反应;组内,组间变异系数10%。该方法对临床样本的检测结果与实际患病状况一致。【结论】成功建立了伪结核抗体间接ELISA检测方法,该方法特异性强、重复性好,可用于临床诊断和批量血清学检测。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究

【目的】布鲁氏菌外膜蛋白BP26是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究采用bp26基因缺失株和BP26蛋白分别与胚胎滋养层细胞(HPT-8)作用,探讨布鲁氏菌bp26基因的生物学功能。【方法】采用Ni柱亲和层析法纯化BP26蛋白,overlap技术构建布鲁氏菌bp26基因缺失株,用BP26蛋白和bp26基因缺失株分别侵染HPT-8细胞,观察细胞形态变化,ELISA检测上清中的细胞因子。【结果】 从布鲁氏菌疫苗株M5-90克隆出bp26基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得纯化的BP26蛋白,经SDS-PAGE验证正确,Western-Blot鉴定具有免疫原性。将目的片段bp26基因的上下臂插入到自杀载体pGEM-7zf中,电转至布鲁氏菌疫苗株M5-90感受态细胞中,成功筛选出了具有遗传稳定性的bp26基因缺失株。用BP26蛋白与bp26基因缺失株分别侵染HPT-8层细胞,BP26蛋白使细胞变形且贴壁不牢,缺失株导致细胞大量脱落溶解,ELISA检测蛋白侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α和LDH均高于PBS对照组,差异极显著（P＜0.01）, 而细胞因子IL-10的分泌下降。缺失株侵染HPT-8细胞诱导产生的细胞因子IL-6、TNF-α均高于M5-90对照组,LDH和IL-10均低于M5-90对照组,差异显著（P＜0.05）。【结论】成功获得了布鲁氏菌BP26蛋白和M5-90Δbp26缺失株,BP26蛋白可以引起HPT-8细胞的炎性反应,有细胞毒性作用,bp26基因缺失株对HPT-8细胞有损伤作用,bp26基因在布鲁氏菌侵染宿主细胞过程中起重要作用。     

抗麦草畏多克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立麦草畏的免疫分析方法,采用碳化二亚胺法将麦草畏(DIC)与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联,分别合成免疫原与包被原;用合成的免疫原免疫新西兰大白兔获得抗麦草畏多克隆抗体,该抗体效价为1∶1.28×105,且该抗体与麦草畏的结构类似物2,3,5-三氯苯甲酸、2,3,6-三氯苯甲酸、2-氨基-3,5-二氯苯甲酸的交叉反应率均小于0.1%。以包被原1∶8 000和多抗溶液1∶80 000的稀释倍数为工作浓度,建立麦草畏间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法,此方法检测麦草畏的线性范围为1～100ng.mL-1,线性回归方程为y=8.684 4ln x+15.001,R2=0.994 4,最低检测限为IC20=1.779ng.mL-1;玉米粉和面粉空白样品的麦草畏添加回收实验表明,麦草畏添加值为5～30μg.kg-1时,玉米粉中的麦草畏回收率为53.08%～92.37%,面粉的回收率则分别为66.5%～94.63%。     

间接ELISA检测减蛋综合征病毒抗体方法的建立

应用SephdexG-200亲和层析获得纯化的减蛋综合征病毒EDSV作ELISA抗原,应用抗鸡Ig轻链单抗1B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测EDSV抗体水平的ELISA方法。确立了将鸡血清100倍稀释监测ELISA效价(ET)的回归方程y=0.59287x+0.75757(r=0.96763)可用于定量测定。血凝抑制(HI)抗体与ELISA方法的比较试验表明,ELISA法比血凝抑制试验敏感2倍以上.     

呼和浩特布鲁氏菌分离株bp26基因的原核表达

目的:克隆布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因并构建原核表达系统.方法:用聚合酶链式反应技术扩增得到布鲁氏菌bp26基因片段,与PEASY-E1载体链接,转入BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测重组蛋白表达,用Western blot鉴定目的蛋白的生物活性.结果:DNA测序结果显示,重组质粒bp26基因的插入位点正确,成功构建了重组质粒PEASY-E1-bp26,经IPTG诱导,表达出大小为27kDa的bp26融合蛋白.结论:获得布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的bp26融合蛋白.     

间接ELISA法检测促卵泡素抗体方法的建立

建立了检测促卵泡素(FSH)抗体的间接ELISA方法,用该法检测由FSH-BSA免疫BaLb/c小鼠所分离的5份待检血清,结果均为阳性。通过反复试验,确立间接ELISA检测FSH抗体的最佳反应条件,即酶标二抗工作浓度为1∶1 200,抗原包被浓度10μg/mL,待测血清最佳稀释度为1∶500,封闭液为1.0%的脱脂奶粉,同时设置抗原阻断试验对结果进行验证。     

2型鸭疫里氏杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

以2型鸭疫里氏杆菌裂解物作为包被抗原,以辣根过氧化物酶标记的兔抗鸭IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功地建立了检测鸭血清中2型鸭疫里氏杆菌抗体的间接EL1SA方法。经检测表明该方法特异性强,敏感性比常规的试管凝集试验高320倍。以该方法对免疫2型鸭疫里氏杆菌灭活油乳剂疫苗的试验鸭进行抗体水平的跟踪测定,发现试验鸭于免疫后7d开始产生抗体,28d达到最高峰,然后开始下降,于免疫后56d其抗体水平仍高于免疫后14d的水平。     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法.克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物.以纯化重组Cb...     

猪细小病毒VP2的原核表达及间接ELISA方法的建立

含有猪细小病毒结果蛋白VP2基因的重组质粒pET32c-VP2,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,重组VP2蛋白高效表达,以包涵体形式存在,经变、复性和纯化后,Western blot显示有良好的生物活性。纯化后的重组蛋白作为抗原,包被酶标板,建立了检测猪细小病毒特异性抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最佳包被浓度为3.1μg/mL;血清最佳稀释度为1∶100,阳性标准初步定为OD待检血清≥0.4且OD待检血清/OD标准阴性值≥2.1。     

副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用

从副结核分支杆菌K-10菌株克隆出840 bp的hed基因片段,插入原核表达载体pET-32a(+),转化至Escherichia coliBL21(DE3),在0.8 mmol.L-1 IPTG诱导下进行表达,纯化重组蛋白,将其进行Western-blot分析、小鼠免疫试验,包被ELISA板,建立间接ELISA方法。结果显示:重组蛋白具有良好的抗原性,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(100倍)和抗原包被浓度(4.4μg.mL-1),该方法具有较好的特异性和敏感性。     

山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法的建立

【目的】制备抗CD58单克隆抗体,在此基础上建立可用于定量检测山羊血清中CD58含量的间接竞争ELISA方法。【方法】以纯化的CD58蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术制备抗CD58单抗,并对其特异性进行鉴定;在此基础上,建立CD58间接竞争ELISA检测方法,对不同生理时期山羊血清中CD58的含量进行检测。【结果】筛选出1株稳定分泌抗CD58单克隆抗体的杂交瘤细胞株G6;玫瑰花环抑制试验和Western-blotting试验表明,制备的细胞株能分泌针对CD58的特异性单克隆抗体;对间接竞争ELISA方法的反应条件进行优化后,建立了检测CD58的间接竞争ELISA方法,该方法最适可测范围为10~1000000 ng/mL,理论最低检测限为3.087 ng/mL,批内和批间平均变异系数分别为3.50%和5.22%;用建立的方法检测未发情和发情山羊血清中CD58含量分别为(32.160±3.69)和(35.929±3.08)μg/mL,怀孕山羊血清中CD58含量为(61.564±5.10)μg/mL。【结论】建立了山羊血清中CD58间接竞争ELISA检测方法,该方法敏感、特异,具有良好的重复性;对不同生理时期山羊血清中CD58含量的检测表明,怀孕山羊血清中CD58含量显著高于未发情和发情山羊。     

鸭圆环病毒抗体的间接ELISA检测方法的建立

鸭圆环病毒(DuCV)是新发现的一种感染鸭的最小病毒,可导致鸭淋巴组织损伤。目前尚无检测其抗体的商品化ELISA试剂盒。为了对鸭群进行DuCV血清流行病学调查,本试验用原核表达了全长DuCV Cap蛋白,Western blot检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化的重组Cap蛋白作为包被抗原,应用30份DuCV抗体阴性血清和16份DuCV抗体阳性血清,建立了检测DuCV抗体的间接ELISA方法,以此方法对从江苏地区收集的部分鸭血清样品进行检测,结果显示DuCV抗体阳性率为26.7%(38/142)。试验证明该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,且方法的变异系数均小于10%。结论:该方法操作简便,可以低成本、大规模地检测鸭圆环病毒抗体。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。