瓜叶菊F3''5''H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3',5'-羟羟基花青素(飞燕草色素及其衍生物)的相对含量较高,类黄酮-3',5'-羟基化酶(F3'5H)是合成这类色素的关键酶.不同物种F3'5'H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3'5'H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3'5'H同源基因(PCFH).cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3'5'H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.     

瓜叶菊F3＇5＇H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3＇,5＇-羟羟基花青素（飞燕草色素及其衍生物）的相对含量较高,类黄酮-3＇,5＇-羟基化酶（F3＇5H）是合成这类色素的关键酶.不同物种F3＇5＇H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3＇5＇H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3＇5＇H同源基因（PCFH）.cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3＇5＇H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.     

茶树生长素外运载体基因CsPIN3的克隆与表达分析

从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到1条与其他植物PIN蛋白高度相似的EST序列,采用反转录PCR结合RACE技术从茶树中克隆到生长素外运载体基因PIN3的全长cDNA序列,命名为CsPIN3 (GenBank登录号为KP896474)。CsPIN3全长2654 bp,包含1926 bp的完整开放阅读框(ORF),编码641个氨基酸;生物信息学分析显示,CsPIN3编码的蛋白质分子量为70.15 kD,理论等电点为8.42,是一种非分泌性蛋白;亚细胞定位显示,CsPIN3主要分布于质膜上,在内质网中有少量分布,是典型的膜蛋白;氨基酸序列分析表明CsPIN3编码蛋白由两端的疏水区和中间的亲水区构成。疏水区内有多个跨膜螺旋,其中N端疏水区有5个跨膜螺旋,C端有4个,与水稻的PIN蛋白结构相似。亲水区存在2个可变结构域,还存在着糖基化位点和磷酸化位点以及调控PIN蛋白内吞作用的NPNXY保守内在构型(Inner Motif, IM),如PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点--TPRXS(N/S)结构域;相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与杨树、葡萄、柑橘、烟草、番茄、马铃薯、和芝麻等植物的PIN序列相似性在80%以上,与茄科植物的亲缘关系最近。在拟南芥PINs蛋白中,AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近。组织表达特异性分析表明 CsPIN3在茶树根、茎、叶、花中均有表达,在花中的表达量较高,在茎、叶中的表达量略高于根部。实时定量PCR分析显示,CsPIN3在龙井43茶树越冬芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间),在茶芽萌动过程中表达上调的速度明显。推测该基因可能与茶树越冬芽休眠的维持和解除相关。     

龙眼DlWRKY57基因克隆与拟南芥遗传转化

以龙眼成熟叶片为材料,利用实验室构建的龙眼转录组数据库,筛选出Dl WRKY57基因c DNA序列,对其开放阅读框(ORF)进行克隆和生物信息学分析。结果表明,Dl WRKY57基因ORF长度为894 bp,编码297个氨基酸,此蛋白属于WRKY基因家族中的域a类,存在1个WRKY结合位点。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,预测定位于细胞核,存在45个氨基酸磷酸化位点。其二级结构由无规则卷曲、琢-螺旋和延伸链构成,其中无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且二级结构与三级结构预测结果高度一致。同源基因进化树分析表明该基因与木薯亲缘关系最近。以p MD18-T和p BI121载体为基础,成功构建了植物超表达载体p BI121-Dl WRKY57,利用农杆菌花序法转化拟南芥,经PCR分子检测,获得含Dl WRKY57基因的拟南芥植株,该超表达载体的遗传转化为Dl WRKY57基因功能的深入研究提供依据。     

芒果FLC同源基因的克隆和表达分析

开花抑制基因FLC (FLOWERING LOCUS C)是春化作用中的关键基因,为探索MADS-box转录因子在芒果花器官发育中的作用,本研究利用RT-PCR克隆得到芒果MADS-box转录因子MiFLC的cDNA全长,序列分析显示该基因具有MADS_MEF2_like和K-box结构域,属于MADS-box基因家族,MiFLC基因编码区长576 bp,编码191个氨基酸,蛋白质相对分子质量22.08 kD,等电点为9.18。MiFLC的生物信息学分析表明该蛋白序列的二级结构主要由α螺旋、无规则转曲及延伸链构成,属于亲水性氨基酸。序列分析和系统进化树分析显示,MiFLC基因编码的蛋白与橙子、枳、龙眼、克莱门柚的蛋白序列同源性高,亲缘关系较近。组织特异性表达分析表明,MiFLC基因在芒果不同品种和每个品种的不同组织部位均有表达,在‘桂七’、‘金煌’、‘凯特’3个品种的表达量呈现出一致性,在营养器官中表达量最高,在花器官中表达量较低,表达量顺序依次是叶茎果花。     

荠菜生长素极性运输基因1(CbPIN1)的克隆与表达分析

为了探讨荠菜PIN1基因的生物学功能,根据Gen Bank中拟南芥PIN1氨基酸序列,设计同源引物,通过RT-PCR技术,克隆了荠菜PIN1基因(CbPIN1)编码区c DNA序列;生物信息学方法分析了荠菜PIN1蛋白结构特征,并进行了亚细胞定位与原核表达;荧光定量PCR方法检测了PIN1组织表达特性;构建了植物表达载体p BI121-CbPIN1,并获得转基因植株。结果表明,CbPIN1 c DNA序列全长1 869 bp,C+G含量为49%。Blast比对结果显示,CbPIN1与拟南芥PIN1基因高度同源,相似性高达93%。进一步分析发现,CbPIN1可编码1条622个氨基酸的多肽,CbPIN1蛋白分子质量为67. 05 ku,等电点为9. 02,碱性氨基酸(K、R)个数为49,酸性氨基酸(D、E)个数为42,疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)个数为241,极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)个数为157。CbPIN1属于跨膜蛋白,含12个丝氨酸磷酸化位点,1个苏氨酸磷酸化位点。亚细胞定位结果显示,CbPIN1定位于细胞膜; CbPIN1在荠菜不同组织均有表达,其中,根中表达最高,种子中表达最低。原核表达显示CbPIN1蛋白大小87. 05 ku。过表达荠菜植株中CbPIN1基因表达量均显著增加。试验结果为进一步分析CbPIN1在荠菜器官发育中的作用奠定了基础。     

棉花GhMGL11基因的克隆和表达分析

为研究陆地棉甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因的结构与功能,本研究以陆地棉中9807叶片为试验材料克隆得到棉花甲硫氨酸裂解酶(Methionineγ-lyase)基因c DNA全长,命名为GhMGL11(Cottongen:Gh_A12G2168)。蛋白序列分析该基因的编码区序列全长1 359 bp,编码452氨基酸;GhMGL11蛋白属于亲水性蛋白,预测含有41个磷酸化位点;亚细胞定位显示位于细胞质,无信号肽。序列比对分析,该基因含有Cys_Met_Meta_PP家族特有的保守结构域Cys_Met_Meta_PP,属于PLP(Pyridoxal phosphate)依赖性氨基转移酶中的一种。系统进化分析,陆地棉GhMGL11蛋白与可可(Theobroma cacao)亲缘关系较近。在陆地棉中发现23个与GhMGL11基因同源的含有Cys_Met_Meta_PP结构域的基因。组织特异性分析,GhMGL11基因在棉花根、茎、叶中均有表达,其中在根中的表达量最高;碱胁迫处理后不同时间内,该基因的表达量先升高后降低,说明该基因表达受碱胁迫影响。     

菊花CmWRKY4基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物生长发育和逆境胁迫应答中具有重要作用。本研究克隆了一个菊花WRKY基因CmWRKY4,编码区长1 344 bp,编码447个氨基酸,预测分子量约为49.69 kD,等电点为6.62。推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的WRKY结构域。亚细胞定位预测CmWRKY4蛋白定位于细胞核。进化树分析发现,CmWRKY4和拟南芥At WRKY3,AtWRKY20和At WRKY25聚在一个分支。组织特异性表达模式分析表明CmWRKY4在检测的组织中都有表达,在根中表达量最低,在叶中表达量最高。Cm WRKY4基因的表达受干旱诱导,说明菊花CmWRKY4基因可能参与菊花对干旱胁迫的应答。     

割手密DREB2类转录因子的克隆与比较分析

DREB类转录因子是一类植物中特有的,在非生物逆境胁迫中起重要作用的调控因子。本研究以割手密为材料,采用同源基因克隆的方法克隆获得2个DREB2类转录因子基因Ss DREB2-1和Ss DREB2-2(Gen Bank登录号分别为KU963264和KU963265)。序列分析表明,这2个基因的长度分别为814 bp和709 bp,分别编码262和227个氨基酸;预测其蛋白质分子量分别为28.66 k D和24.95 k D,等电点(PI)分别为5.42和6.47。氨基酸亲水/疏水性分析表明,这2个转录因子属于亲水性蛋白。多序列比对分析表明,两基因序列的相似性为98.7%。原核表达分析表明,这2个基因编码区能正常表达出目的蛋白,说明得到的这2个基因为功能基因而非假基因。     

秦川牛CDS1基因克隆、分子特征及组织表达分析

为明确秦川牛CDS1基因的编码序列、分子特征及其在不同组织的表达特点，以秦川牛为研究对象，利用PCR扩增技术克隆CDS1基因的全编码区序列，利用生物信息学方法分析其全编码区的序列特征，以GAPDH为内参基因，采用qRT-PCR技术检测CDS1基因在脑、睾丸、胰、肺、脾、肾、瘤胃、背最长肌、肝、肌内脂肪和心组织中的表达水平。结果显示，秦川牛CDS1基因编码区为1 392 bp,编码464个氨基酸，CDS1基因在不同物种间具有较高的保守性，且与瘤牛的同源性最高；CDS1基因编码蛋白为疏水性不稳定跨膜蛋白，主要由α-螺旋及不规则卷曲构成；亚细胞定位分析表明，CDS1蛋白主要分布于内质网和线粒体；蛋白互作分析表明，其与PGS1、PPAPDC1系列、CDIPT、PLD系列、CRLS1等与磷脂合成相关的核糖蛋白存在相互作用，提示CDS1基因参与调节磷脂的合成代谢过程；组织表达分析表明，CDS1基因在各个组织均有广泛表达，且在睾丸中表达量最高，在脑的表达水平也较高，二者均显著高于其他组织的表达水平，在心的表达量最低。     

Pheophytinase activity and gene expression of chlorophyll-degrading enzymes relating to UV-B treatment in postharvest broccoli (Brassica oleracea L. Italica Group) florets

Pheophytinase (PPH) activity and gene expression of chlorophyll (Chl)-degrading enzymes relating to UV-B treatment in postharvest broccoli (Brassica oleracea L. Italica Group) florets were determined. PPH is involved in the dephytylation of Mg-free Chl a, pheophytin (Phy) a. However, in vitro chlorophyllase (Chlase, EC.3.1.1.14) also uses Phy a as a substrate to produce pheophorbide (Pheide) a by dephytylation. For an accurate determination of PPH activity, the PPH protein fraction was separated from Chlase protein by ammonium sulfate precipitation. The protein precipitated by 45-60% saturated ammonium sulfate included a little bit of Chlase activity and was suitable for PPH determination. PPH activity in broccoli florets treated with a UV-B dose of 19 kJ m⁻² was repressed for the first 2 d of storage at 15 °C, whereas it increased gradually with senescence of control broccoli florets. The expression level of BoCLH1 was reduced in broccoli florets on day 4 of storage, while BoCLH2 and BoCLH3 were up-regulated with UV-B treatment. A high BoPAO expression level was found in senescent broccoli florets, and the up-regulation of this gene was delayed by UV-B treatment. The highest expression level of BoPPH was found in the control, and its expression was clearly repressed by UV-B treatment on day 2 of storage. We suggest that the up-regulation of Chl-degrading enzyme genes could be delayed by UV-B treatment, resulting in the suppression of floret yellowing in stored broccoli.     

海马齿Spmet基因表达产物的亚细胞定位

为研究从海马齿(Sesuvium portulacastrumand L.)中克隆的Spmet基因在植株体内亚细胞水平上的分布情况及组织表达的特异性,将Spmet基因的编码区定向克隆至植物表达载体pCAMBIA-1304上,使其与mgfp（绿色荧光蛋白）基因融合,构建Spmet基因植物瞬时表达载体,使用基因枪法将该表达载体导入洋葱表皮细胞,通过荧光激发,在荧光显微镜下观察洋葱表皮细胞中的绿色荧光部位,确定其在细胞中的表达部位。同时利用半定量PCR的方法对其在根、茎、叶中的表达特性进行分析。结果表明,该基因在海马齿植物的根、茎、叶中均有表达,表达量为叶>茎>根,融合蛋白主要分布在洋葱表皮细胞的细胞核上,细胞膜上也有微量表达。说明海马齿2型金属硫蛋白基因在海马齿植物中属于组成型表达,同时是一个核表达的基因,该结果为进一步研究Spmet基因在抗重金属方面发挥的作用打下了基础。     

露地菊(Chrysanthemum×grandiflora)CgDREB基因克隆和生物信息学分析

DREB转录因子在植物抗逆过程中起关键性作用,它可以激活一系列抗逆功能基因的表达从而综合提高植物的抗逆性。为探究露地菊DREB基因的功能,本研究通过结合RNA-Seq和RT-PCR技术从露地菊‘纽9717’中克隆得到CgDREB基因,并对该基因及其蛋白进行生物信息学和表达模式分析。结果显示,CgDREB基因ORF全长450 bp,编码149个氨基酸,预测蛋白相对分子量16.742 kD,理论等电点9.32,为亲水性蛋白,没有跨膜结构,无信号肽。功能结构域分析表明其具有一个高度保守的AP2/ERF结构域。同源性分析其属于AP2/ERF转录因子家族DREB亚组A-5组。蛋白质二级结构中无规则卷曲占57.05%,α-螺旋占28.86%,延伸链占10.07%,β-转角占4.03%。三级结构显示其以单体蛋白结构存在。RT-qPCR分析表明,高盐、干旱、低温和ABA均能诱导CgDREB基因的表达。本研究为深入了解露地菊A-5组DREB转录因子及其抗逆调控机制提供基础,为露地菊品种改良提供理论依据。     

TMV载体上发生的前体mRNA基因剪接效应研究

根据以往的报道,TMV基因只存在于细胞质中且不发生基因剪接,前体mRNA(Pre-mR鄄NA)的剪接只能发生在细胞核中。本研究应用RT-PCR,DNA序列测定及GUS INTRON的点突变和荧光检测等研究手段,首次发现TMV载体中GUS基因的表达和前体mRNA的剪接同时发生,证明了GUS基因在TMV载体上的剪接效应。     

TMV载体上发生的的前体mRNA基因剪接效应

根据以往的报道,TMV 基因只存在于细胞质中且不发生基因剪接,前体mRNA(Pre-mRNA)的剪接只能发生在细胞核中。本研究应用RT-PCR,DNA序列测定及GUS+INTRON的点突变和荧光检测等研究手段,首次发现TMV载体中GUS基因的表达和前体mRNA的剪接同时发生,证明了GUS基因在TMV载体上的剪接效应。     

绿竹cab-BO2基因的克隆及其表达载体的构建

捕光叶绿素a/b结合蛋白基因是绿色植物光合系统中的重要基因,其编码的蛋白与色素所形成的蛋白复合体在光化学反应、光保护等方面都起着重要的作用.采用RT-PCR技术和与RACE-PCR技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA编码区,命名为cab-BO2(GenBank登记号:EF088668).该基因编码区长为792 bp,编码263个氨基酸.通过加酶切位点的方法,将基因的编码区直接构建到载体pBI121多克隆位点.经过酶切检测,获得了包含35S启动子、cab基因、GUS报告基因和NOS终止区域的植物表达载体.     

棉花GhEPSPS基因的原核表达载体的构建及诱导表达

目的在于构建棉花GhEPSPS基因的原核表达载体,并在宿主大肠杆菌中成功诱导表达。利用RT-PCR技术从陆地棉苏棉18中克隆获得GhEPSPS基因的开放阅读框序列,连接到p EASY-Blunt平端载体,构建获得重组载体p EASY-Blunt-GhEPSPS;以该重组载体为模板,PCR获得两端含有Eco RⅠ和XhoⅠ酶切位点的GhEPSPS基因CDS序列,通过这2个酶切位点插入到p ET32a载体,构建获得原核表达重组载体p ET32a-GhEPSPS,转化到宿主菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测目的基因的表达情况。研究结果表明,成功克隆获得了棉花GhEPSPS基因的CDS序列,并成功构建了该基因的原核表达载体,目的基因能够在宿主菌中被诱导大量表达。该研究结果将为深入研究棉花EPSPS酶的结构、功能以及酶学特性提供重要的研究基础。     

稻瘟病新抗性基因Pi39候选基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

Pi39是位于水稻第12染色体上的稻瘟病新抗性基因,为了明确其功能,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建候选基因的敲除载体。通过对候选基因序列分析,将合成的靶位点序列插入入门载体pENTR-sgRNA,再与表达载体Cas9发生重组。本研究首先在候选基因的第一个外显子区域找到了2个带有PAM序列的靶位点,将2个目的小片段依次克隆到pENTR-sgRNA载体上。通过菌落PCR检测及测序,结果表明目的小片段插入位置正确。将入门载体与表达载体进行重组反应后,阳性克隆经菌落PCR和质粒DNA酶切鉴定并测序,结果表明重组载体构建成功。本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除载体操作简单,耗时短,为进一步开展Pi39候选基因的功能研究奠定了基础。     

玉米Zmcen基因的克隆、表达与生物信息学分析

为研究玉米Zmcen基因的特征及生物学功能,并对其编码蛋白结构与功能进行分析。以玉米c DNA为模板,将其构建到带有GST表达标签的原核表达载体p GEX-6p-1中,构建的重组载体p GEX-6p-ZmCen转化至大肠杆菌BL21(DE3),通过0.3 mmol/L IPTG在27℃下诱导表达20 h,获得了可溶性的GST融合蛋白。采用GST亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经12%SDS-PAGE电泳和GST标签抗体Western Blotting检测,鉴定为含有GST-Tag的融合蛋白,纯化的蛋白经Pre Scission Protease(PPase)过夜酶切切除GST标签,得到较纯的ZmCen蛋白;同时利用生物信息学的方法,解析ZmCen蛋白质的结构特征。结果表明,该基因定位于玉米第7#染色体上,全长基因含有6个外显子和7个内含子,519 bp的开放阅读框,编码172个氨基酸,分子量约为19.78 k Da,等电点为4.78。采用maize GDB数据库对玉米整个生命周期的表达水平进行分析表明,细胞分裂旺盛的部位,Zmcen基因的表达量较高。对16种植物进行系统发育树分析显示,Zmcen基因与水稻、小麦、拟南芥等的centrin基因同源性高达80.21%,该结果为探索Zmcen蛋白的未知生物学功能提供了线索。     

Significance of <Emphasis Type="Italic">CmCCD4a</Emphasis> orthologs in apetalous wild chrysanthemum species,responsible for white coloration of ray petals

Most chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium Ramat.) flowers have a central capitulum, composed of many disc florets that is surrounded by ray petals. CmCCD4a, a gene that encodes a carotenoid cleavage dioxygenase (CCD), is expressed specifically in the ray petals of chrysanthemum cultivars, and its expression leads to white ray petals as a result of carotenoid degradation. Here, we show that wild chrysanthemums with white ray petals have CmCCD4a orthologs, whereas those with yellow ray petals lack these orthologs, as is the case in chrysanthemum cultivars. CmCCD4a orthologs also exist in some lines of Chrysanthemum pacificum and Chrysanthemum shiwogiku, even though these species lack ray petals. Interspecific hybridization between C. shiwogiku and a yellow-flowered chrysanthemum cultivar showed that the CmCCD4a orthologs from C. shiwogiku lead to the development of white ray petals. This indicates that the translation products of the CmCCD4a orthologs maintain enzymatic activity that can degrade carotenoids in chrysanthemums, irrespective of whether or not the ray petals that CmCCD4a expression actually occurred.