GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性分析

TCP转录因子是参与植物生长发育的特异性家族蛋白,但是棉花TCP转录因子家族中的大多数成员功能尚不清楚。为了定位GbTCP5转录因子调控的靶基因,本研究通过Plant CARE在线网站分析棉花纤维发育基因GbGL3上游3 000 bp启动子中的顺式作用元件,构建含有TCP顺式作用元件的载体PHISII-GbGL3和酵母表达载体p GADT7-GbTCP5,通过酵母单杂交分析GbTCP5与GbGL3启动子中TCP顺式作用元件的结合特性。结果表明：GbGL3上游3 000 bp启动子中包含TCP顺式用作元件和功能各异的顺式作用元件,酵母单杂交实验结果表明GbTCP5能够与GbGL3启动子中含有的TCP顺式用作元件结合。本研究为进一步了解GbTCP5转录因子的功能提供依据。     

玉米生长素响应因子家族基因的表达模式分析

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是一类重要的转录因子,通过特异性地结合生长素响应元件调节下游靶基因的转录,参与诸多植物生长发育过程的调控。玉米中有许多ARF家族基因,但其表达模式有待深入研究。本研究分析了玉米ARF家族基因在不同组织器官中的表达,发现除ARF10、ARF16和ARF34组成型表达外,其余32个ARF基因的表达水平在生殖器官中要明显高于营养器官。对ARF基因启动子区的顺式作用元件分析显示,28个ARF基因的启动子区含有逆境胁迫相关顺式元件,实时定量PCR分析结果显示,多个ARF基因分别响应冷、热、盐和渗透胁迫。研究结果不仅暗示了ARF家族基因在玉米生殖生长和非生物逆境胁迫响应中的重要性,也为全面解析ARF基因在玉米中的生物学功能提供有用信息。     

陆地棉NAC转录因子基因GhNAC6的克隆、表达和耐盐性分析

【目的】NAC(NAM-ATAF-CUC)家族是植物细胞内特有的1类转录因子家族,参与植物的抗逆过程。为了研究棉花抗逆的分子机制,本研究从陆地棉TM-1中克隆到1个NAC转录因子基因并研究了其功能。【方法】根据其序列同源性和进化分析结果,将该基因命名为GhNAC6,本文对GhNAC6进行了生物信息学和表达分析,并利用病毒诱导基因沉默技术在棉花中沉默GhNAC6的表达。【结果】GhNAC6全长为1629 bp,包含2个内含子,其中编码区为900 bp,编码1个相对分子质量为33.9×10~3、等电点为6.18的蛋白。GhNAC6启动子区段包含多个与诱导表达和组织特异表达相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果表明,GhNAC6在棉花发育的不同时期具有时空表达差异性;实时荧光定量核酸扩增检测结果显示GhNAC6还受到植物激素水杨酸、乙烯利、茉莉酸甲酯和逆境胁迫低温、高温、高盐、伤口的诱导。干涉GhNAC6基因发现,降低GhNAC6基因的表达能增强棉花对盐胁迫的耐受性。【结论】研究结果表明GhNAC6可能参与了棉花发育、逆境响应和激素信号传导的过程。     

基于表达谱分析陆地棉DUF642基因家族抗逆功能

【目的】DUF642(Domain of unknown function 642 genes)是1个未知功能基因家族,在植物逆境胁迫响应中发挥重要作用。本研究旨在分析其在棉花抗逆反应中的功能。【方法】基于陆地棉基因组数据,系统地鉴定DUF642基因家族。利用生物信息学方法分析基因结构、理化性质、亚细胞定位、亲缘关系、启动子顺式作用元件等。应用转录组数据和实时定量聚合酶链式反应技术分析该家族基因在不同组织和多种逆境(冷、热、干旱、盐和黄萎病菌)胁迫下的表达规律。【结果】陆地棉基因组中包含23个DUF642基因,分布于14条染色体和1条Scaffold;编码的蛋白含有1～2个保守的DUF642结构域,多定位在细胞膜。DUF642家族基因可分成4个亚组,在进化上相对保守。DUF642基因具有较为广泛的组织表达类型,其中根和叶中表达较高。通过启动子和胁迫表达分析,推测Gh DUF642-09参与棉花抗盐胁迫;GhDUF642-08和GhDUF642-19参与棉花抗黄萎病;GhDUF642-02、GhDUF642-14和Gh DUF642-17参与棉花生长发育和抗逆胁迫。【结论】本研究结果为进一步研究DUF642基因家族功能和棉花抗逆分子机制提供了重要的理论依据。     

小麦G2-like转录因子家族基因鉴定与表达模式分析

Golden2-Like (G2-like)转录因子,是属于MYB类转录因子中GARP超家族的成员,在调节叶绿体发育中起重要作用。本研究利用生物信息学方法对小麦G2-like基因进行了全基因组鉴定,并对其理化性质、亚细胞定位、启动子顺式作用元件及对非生物胁迫和激素的响应模式进行了分析。从小麦中共鉴定出87个G2-like基因,不均匀的分布在小麦21条染色体上,系统发育分析将这些基因分为14个亚族。蛋白质二级结构预测表明,小麦G2-like基因的氨基酸序列均以α螺旋和随机卷曲为主要结构。启动子顺式作用元件分析表明其上游2 kb区域含有7种(P-box、SpI、LTR、ABRE、MBS、TGA-element和AE-box)与逆境胁迫诱导相关顺式作用元件。其中Ta3AG2-like19含有顺式调控元件结合位点最多,一共有18个结合位点。qRT-PCR验证发现,Ta3AG2-like19、Ta3AG2-like20、Ta4AG2-like29和Ta6AG2-like52在PEG和盐胁迫下以及GA、IAA和ABA激素诱导下表达量显著上调,这些基因可能介导了小麦对多种非生物逆境的响应。     

水稻CNGCs家族的鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

为了解水稻CNGCs家族成员的基因结构、进化特征、亚细胞定位、启动子顺式作用元件和生物学功能,本研究利用生物信息学的手段对水稻CNGCs家族进行鉴定,运用RT-qPCR的方法分析OsCNGCs在非生物胁迫下的诱导表达模式。结果表明,水稻共有16个CNGCs,分布在1、2、3、4、5、6、9和12号染色体上。进化树分析显示OsCNGCs可分为4个大组(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ),而Ⅳ组可以细分为Ⅳ-A和Ⅳ-B 2个亚组。OsCNGCs启动子区域存在多种顺式调控元件,包括各种类型的光响应元件、厌氧诱导响应元件、逆境相关转录因子结合元件、防御和逆境响应元件、低温响应元件以及各种植物激素响应元件等,暗示OsCNGCs在响应多种激素和非生物胁迫中可能存在重要调控作用。多种非生物胁迫诱导表达分析表明,大多数OsCNGCs基因表现出明显的差异表达。本研究为解析CNGCs家族基因在水稻应对非生物胁迫中的功能提供了参考。     

棉花光合基因GhRCAα启动子的克隆及活性分析

为了克隆棉花Rubisco活化酶基因(RCA)启动子,研究其表达调控的分子机制,以百棉1号为材料,对GhRCAα启动子区2 000 bp的片段进行克隆、顺式作用元件分析以及活性分析,结果表明,许多重要的顺式作用元件包括响应于光、生物钟、逆境胁迫、植物激素以及其他的基本顺式作用元件特异地存在于GhRCAα启动子区;进一步对GhRCAα进行表达特性分析发现,该基因在光合作用进行的主要位置叶片中表达量最高,在其他组织表达量很低,其表达具有组织特异性,这与该启动子区存在许多光响应及组织特异性表达相关元件的结果相一致;将克隆的GhRCAα启动子片段以烟草叶片为受体材料进行瞬时表达分析表明,GhRCAα启动子可以驱动GUS基因的表达,表明克隆的启动子片段具有驱动目标基因表达的活性。克隆的GhRCAα启动子可能是一种组织特异型启动子,有望用于植物的遗传转化,进而更好地调控重要基因的特异性表达。     

番茄NAC转录因子SlNAC80的克隆及表达分析

为进一步明确该基因的分子特征及表达特性,通过RT-PCR从番茄中克隆了低温响应NAC转录因子SlNAC80,该基因开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸。Sl NAC80蛋白相对分子量为38.19 k Da,等电点为5.27,N-端具有典型的NAC保守结构域,包含A、B、C、D、E 5个亚结构域。实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,Sl NAC80在番茄各组织中均有表达,以在绿果和衰老叶中的表达量最高,在红熟果中的表达量最低。对启动子区序列进行预测分析发现,Sl NAC80启动子区含有许多响应激素(ABA、GA、SA及ETH)和逆境(低温、脱水及盐胁迫)的顺式作用元件,如ERELEE4、GARE1OSREP1、LTRE1HVBLT49、GT1GMSCAM4、MYB1AT、MYCATERD1、MYCATRD22、WBOXNTERF3及WRKY71OS等。q PCR分析结果也证实该基因的表达受低温、干旱、高盐、甲基紫精、ABA及乙烯处理诱导。这些结果表明,Sl NAC80可能在番茄非生物逆境应答中发挥重要调控作用。     

二穗短柄草逆境诱导型启动子pBdDREB-47的克隆及功能验证

前期研究分析二穗短柄草逆境胁迫下的AP2/EREBP基因家族的表达谱时,发现Bd DREB-47响应多种逆境胁迫,因此本研究利用PCR的方法克隆了该基因上游1 388 bp的启动子区域,并命名为pBdDREB-47。启动子分析软件Plant CARE分析表明:pBdDREB-47含有TATA-box、CAAT-box等启动子核心元件,同时还含有LTR、ABRE等多种胁迫响应相关元件。因此我们将pBdDREB-47构建到启动子检测载体p CAMBIA1381-GUS上,形成p CAMBIA1381-pBdDREB-47-GUS,以检测其启动子活性。通过农杆菌介导法转化烟草,得到的转基因烟草T1代植株GUS染色结果表明:该启动子在冷、干旱及盐胁迫条件下能够显著诱导GUS报告基因的表达,可进一步用于植物抗逆遗传育种改良工作。     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

棉花转录因子GhWRKY4基因的克隆及特征分析

 本研究从陆地棉中克隆得到GhWRKY4基因,全长cDNA是1281 bp,包含1083 bp的开放阅读框,编码的360个氨基酸属于IIcWRKY转录因子家族。分析GhWRKY4基因结构表明其有三个外显子和两个内含子。GhWRKY4蛋白的亚细胞定位实验表明其定位在洋葱表皮细胞核。实时荧光定量分析结果显示GhWRKY4在棉花的根、茎、叶和花中均有表达。染色体步移得到了GhWRKY4的5’端侧翼序列,生物信息学软件预测表明GhWRKY4包含一系列和胁迫基因调控相关的反式作用元件,表明GhWRKY4参与植物对盐害和冷害胁迫的反应。     

转GHABF4转录因子棉花植株的耐盐性研究

AREB/ABFs转录因子家族基因主要参与干旱、高盐、低温等胁迫应答反应。为了获得具有较高耐盐水平的棉花新种质材料,通过农杆菌介导法将耐盐转录因子基因(GHABF4)导入陆地棉中棉35中,通过对转化植株的卡那霉素初步筛选及T1、T2、T3目的基因PCR的分子检测,获得T3转基因棉花纯合系。通过盐胁迫试验对5个T3转基因棉花株系和非转基因棉花对照进行耐盐性分析。结果表明,在200 mmol/L Na Cl胁迫下,与非转基因对照相比,5个转基因棉花株系株高提高2.5~4.4 cm,地上部分的鲜质量增加3.6%~11.8%;且抗氧化物酶SOD、POD、CAT活性以及叶绿素含量提高。在盐胁迫条件下,转GHABF4基因棉花表现出优良的生长和生理优势,转GHABF4基因能够提高棉花的抗盐能力。     

陆地棉幼苗NaCl胁迫下转录因子表达的转录组学分析

以棉花耐盐种质早熟长绒7号和感盐种质南丹巴地大花为材料,利用转录组测序(RNA-Seq)技术分析2个种质在200 mmol L^–1 NaCl胁迫4和24 h后幼苗叶片的转录因子家族及转录因子的表达情况。结果表明,从样本中鉴定出54个转录因子家族的2815个转录因子。盐胁迫4 h后,长绒7号有249个转录因子基因表达发生变化;南丹巴地大花中有261个转录因子基因表达发生变化。在胁迫24 h后, 2个种质对盐响应的转录因子数量均剧增。只在耐盐种质长绒7号特异表达的有106个(4 h)和184个(24 h)转录因子基因,对于2个种质共同表达的转录因子有143个(4 h)和282个(24 h)。通过筛选,鉴定出26个与耐盐相关的转录因子家族124个转录因子基因,并采用荧光定量验证转录组数据的准确性。推测高表达的11个转录因子的基因CotAD_66280 (HD-ZIP)、CotAD_47058 (ERF)、CotAD_18472 (G2-like)、CotAD_04289 (C2H2)、CotAD_57763 (HSF)、CotAD_23656 (TCP)、CotAD_02221 (ERF)、CotAD_23975 (WRKY)、CotAD_54036 (MYB)、CotAD_27788 (NAC)和CotAD_23815 (HSF) 有可能与陆地棉抗盐性密切相关,可作为陆地棉耐盐育种的候选基因源。     

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色较深,茎和荚皮染色较浅,表明pGhHAK5驱动的GUS主要在拟南芥成熟的根和地上部维管束组织中表达。进一步低钾诱导表达特性分析表明, PGhHAK5驱动的GUS在拟南芥幼苗幼嫩根中的表达很弱,且其表达不受低钾胁迫诱导而增强,表明PGhHAK5可能是一个主要在成熟根中具有功能的低钾诱导型启动子。转录组分析和荧光定量PCR结果表明, GhHAK5主要在成熟的根中表达,且其表达受发育时期的影响,该结果与pGhHAK5驱动的GUS在拟南芥根中的表达结果一致。本研究结果有助于深入了解GhHAK5表达调控的分子机制,并为棉花钾吸收效率的提高及钾高效棉花品种的培育提供理论依据。     

水稻耐旱性基因OsERF65的克隆、表达及转录自激活活性分析

ERF家族转录因子普遍存在于植物中,在植物生长发育、抵抗逆境的过程中发挥着重要作用。本研究从‘珍汕97B’中克隆到一个耐旱相关基因OsERF65,属于ERF转录因子家族的成员。生物信息学分析表明,OsERF65含有一个保守的AP2结构域,与AtERF73等同源蛋白的亲缘关系较近。OsERF65的启动子区域含有多个响应非生物胁迫及激素处理的顺式作用元件,定量PCR结果显示该基因的表达明显受干旱、高盐等非生物胁迫处理的诱导;酵母中转录激活活性结果显示OsERF65具有一定的转录自激活活性;烟草瞬时表达结果表明Os ERF65蛋白定位于细胞核中。本研究为进一步研究OsERF65的生物学功能奠定了一定的基础。     

棉花种子特异表达α球蛋白A基因启动子的功能分析

研究植物种子特异启动子具有重要的理论和实际意义。本文研究了棉花α球蛋白A基因启动子,该启动子序列全长为1640 bp,作用元件分析表明该区域除了具有核心调控序列外,还含有多个与组织特异性相关的顺式作用元件。设计其5'端构建4个不同长度的缺失、融合GUS基因的表达载体,并通过蘸花法分别转化拟南芥。转基因拟南芥GUS表达分析结果表明,该启动子能驱动GUS基因在胚、露白的种子、子叶期的幼苗中表达,而二叶期的幼苗、根、茎、莲座叶、茎生叶和花苞组织则没有表达,说明棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子。208 bp长度的启动子足以维持其种子特异表达功能,而且在启动子的-684和-208区域之间可能存在负调控元件或负调控区域。分析棉花α球蛋白A基因启动子是一个种子特异性启动子,其基本启动子区域不长于208 bp。     

马铃薯HD-Zip I家族ATHB12基因的克隆及功能鉴定

HD-Zip I是一类植物特异转录因子, 在植物应对外界逆境胁迫过程中有重要的调控作用。本研究从马铃薯栽培品种甘农薯2号中克隆了HD-Zip I转录因子ATHB12基因, 其开放阅读框为759 bp, 编码252个氨基酸残基。该基因位于马铃薯1号染色体, 其启动子区含有ABRE、LTRECOREATCOR15和WBOXATNPR1等多种响应非生物胁迫(ABA、低温、脱水及高盐)的顺式作用元件。ATHB12基因在马铃薯根、茎和叶中均有表达, 其根中表达量最高。qRT-PCR分析证实该基因的表达受聚乙二醇(PEG)、NaCl和ABA诱导, 受低温抑制。构建了由组成型表达启动子CaMV 35S驱动的ATHB12基因的过表达载体, 通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转基因植株。干旱处理后, 转基因植株叶片中丙二醛含量显著低于非转基因植株(P<0.05), 而脯氨酸含量显著高于非转基因植株(P<0.05); 转基因植株根鲜重和干重均高于非转基因植株; 说明马铃薯ATHB12基因可能参与了逆境胁迫的响应。     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。