口蹄疫病毒AF72株 3D聚合酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用RT—PCR方法扩增口蹄疫病毒（FMDV）AF72株的3D聚合酶基因,并将其克隆至pGEM—Teasy载体,测序分析结果表明,AF72 3D聚合酶基因与GenBank中公布的其他4个参考序列均具有较高的同源性。将目的基因插入原核表达载体pET-30a（＋）中,构建了重组表达质粒pET-3D,鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,3D聚合酶基因在大肠杆菌中获得了正确表达,目的蛋白的分子量为46ku。Western blot检测结果显示,表达产物可以与抗A型FMDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

鸡贫血病毒VP1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据鸡贫血病毒Cux_1株基因组序列设计了一对引物,通过PCR扩增出VP1基因。将扩增出的片段克隆到pGM_T载体上,通过测序分析证实该片段与鸡贫血病毒Cux_1株的VP1基因序列一致。然后将克隆化VP1基因亚克隆到PET_32a( )载体上并进行原核表达。SDS_PAGE和Western Blot分析表明,一个分子质量为70.4 kDa的重组蛋白获得了成功表达,并且鸡贫血病毒阳性血清能和重组蛋白发生反应。     

牡丹PsSPL3基因的克隆和表达特性分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)转录因子在植物多个生理过程中发挥重要的生理功能,为了研究其在牡丹花芽休眠进程中的作用机理,采用RACE方法,从牡丹花芽中克隆得到了一个SPL基因。该基因全长cDNA 1 057 bp,完整开放阅读框为549 bp,编码182个氨基酸,Blast分析表明,编码的氨基酸序列中具有SBP-box基因家族所特有的SBP-box保守结构域。与拟南芥已知SPLs蛋白构建进化树结果表明,牡丹SPL蛋白与At SPL3聚为一支,该基因被命名为PsSPL3。生物软件预测PsSPL3蛋白分子量为20.349 4 kDa,理论等电点为9.62。同源性分析了牡丹PsSPL3与其他已知植物的SPL3,相似性为47.98%~69.46%,其中与白桦的SPL3蛋白相似性最高,为69.46%。实时定量PCR分析PsSPL3基因在初花期牡丹不同组织中和花芽休眠过程中的表达水平,结果表明,PsSPL3基因在不同组织中表达差异较大,其中在根中转录水平最高,在茎和花瓣中次之;PsSPL3基因在休眠进程中的转录水平呈先上升后下降趋势,其中低温处理14 d时,PsSPL3基因的表达量达到最高。低温7 d结合外源施加GA3的牡丹花芽中PsSPL3基因的表达量显著增加,推测PsSPL3基因的转录受GA3诱导来促进牡丹花芽内休眠解除的进程。     

杨树PePIF3基因的克隆与表达分析

生物节律基因直接影响植物的生长发育,光敏色素相互作用因子3(phytochrome-interacting factor3,PIF3)属碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族,是生物节律中的一个关键因子,在分子水平上对植物所受到的环境变化起协同调控作用。本研究以‘南林895’杨(Populus deltoides×P.euramericana’Nanlin 895’)为材料,通过克隆获得杨树Pe PIF3基因,分别为Pe PIF3-1和Pe PIF3-2序列,长度为1686 bp和2142 bp,编码561个氨基酸和713个氨基酸,且均为亲水性蛋白。对Pe PIF3进行多序列比对分析,发现其与毛果杨和胡杨同源性最高。组织特异性分析显示PePIF3在杨树幼叶中表达量最高,在柄、茎和根组织中表达都较低。对自然条件下的杨树成熟叶中PePIF3的生物节律性变化规律分析发现其在黑暗中不断累积,上午表达量达最高,以后呈下降趋势。在全黑暗条件下,14 h前PePIF3-1和Pe PIF3-2二者的表达量变化趋势相似,但14 h后二者的表达量呈相反变化趋势。     

洋金花托品酮还原酶Ⅰ基因的克隆与表达分析

洋金花的入药成分是莨菪碱和东莨菪碱,托品酮还原酶Ⅰ(tropinone reductase I, TRI)是托品烷类生物碱合成途径中的关键酶,该酶的编码基因是TAs代谢工程研究重要的靶标基因。本研究从洋金花中克隆TRⅠ基因,命名为Dm TRⅠ(GenBank登录号:MW455085)。DmTRⅠ基因包含一个822 bp的完整开放阅读框,编码273个氨基酸。生物信息学分析发现,DmTRⅠ为稳定的亲水性蛋白,是DmTRⅠ作为辅酶NADPH的结合位点,有TGXXXGXG保守结构域。从生物进化关系上发现,DmTRⅠ与同为茄科的颠茄、三分三等5种植物的TRⅠ聚为一支,且与曼陀罗属的木本曼陀罗TRI亲缘关系最近。进一步以ACTIN和PGK双基因为内参基因,DmTRⅠ基因表达分析显示,DmTRⅠ在根、茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中根的表达量最高,花,茎、叶的表达量较低,在果实中表达量最低。DmTRⅠ基因的获得及表达分析为进一步研究洋金花TAs的生物合成提供理论依据。     

桂花OfF3'H基因的克隆与表达分析

类黄酮3'-羟化酶(F3'H)属于细胞色素P450单加氧酶家族,是苯丙烷类代谢途径关键成员,在植物色泽形成及类黄酮成分调控方面起重要作用。本研究以四季桂‘金玉台阁’为实验材料,采用cDNA末端快速扩增法(RACE)从盛花末期小花cDNA中克隆了桂花OfF3'H基因(GenBank编号:MH509392)。序列分析结果显示该基因全长为1 856 bp,其中5'端非翻译区长度为102 bp,3'端非翻译区长度为191 bp,开放阅读框长度为1 563 bp,编码由520个氨基酸残基组成的蛋白质。系统进化分析表明Of F3'H含有植物F3'H蛋白典型的保守结构域,且与猕猴桃的AcF3'H蛋白亲缘关系最近。桂花花期不同阶段生理与分子研究发现初花期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量均为最低,而花谢期OfF3'H基因表达量和总黄酮含量达到最高。此外,Of F3'H存在10个潜在的磷酸化位点,其中第83位点的丝氨酸和第304位点的苏氨酸在不同植物间高度保守。本研究为深入研究桂花花色形成及植物类黄酮合成调控的分子机制提供一定的理论依据。     

芸香草CdLEA3基因的克隆及原核表达分析

本研究以芸香草为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术对芸香草CdLEA3基因进行了分离克隆以及原核分析,并进行了生物信息学分析与原核表达分析.结果显示,芸香草CdLEA3基因的cDNA全长为934 bp,含627 bp的最大开放阅读框,编码208个氨基酸;生物信息学分析表明,CdLEA3基因编码蛋白的分子质量预测为...     

pCDNA3-CT真核表达质粒的构建及其在COS-1细胞中的表达

通过酶切方法自含鸡甲状旁腺素(CT)基因的克隆质粒pGEM-T-CT中扩增CT基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CT在COS-1中的表达。     

谷子SiHd3a基因的克隆及表达分析

分析谷子成花素基因(Hd3a)在不同光周期条件下的表达规律,旨在揭示成花素基因在光周期调控谷子开花过程中扮演的角色。首先利用生物信息学方法获得位于谷子4号染色体的成花素基因序列(Seita.4G067600),命名为SiHd3a,然后根据基因序列设计1对特异引物,提取谷子农家种黄毛谷总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到黄毛谷SiHd3a基因cDNA序列,其长度为792 bp,包含一个537 bp的CDS区,编码178个氨基酸;预测SiHd3a蛋白的分子质量为19.74 ku,等电点为6.82,初步判断其为亲水蛋白;蛋白质的二级结构中无规则卷曲所占比例最高(43.26%),其次为延伸链(β-折叠,29.21%)、α螺旋(16.29%)、β转角(11.24%);亚细胞定位分析发现,SiHd3a蛋白定位在细胞质和细胞间质;基于Hd3a蛋白序列进化分析发现,谷子与野生黍、玉米、高粱之间的亲缘关系比较近,聚在一组,而与水稻亲缘关系较远。半定量PCR发现,SiHd3a基因在短日照条件下表现为昼夜节律性表达,在早晨6:00、中午12:00各有1个表达峰,而在长日照条件下基因24 h内表现稳定表达水...     

百子莲开花相关基因ApVIN3的克隆及表达分析

研究以百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis)茎尖组织为材料,利用RACE (cDNA末端快速扩增)方法,获得百子莲VIN3基因c DNA全长序列,命名为ApVIN3,GenBank登录号为KJ472789。序列分析表明,百子莲ApVIN3基因cDNA全长1 943 bp,其中开放阅读框为1 680 bp,编码559个氨基酸,5’非编码区(5’UTR)和3’非编码区(3’UTR)分别为88和175 bp。ApVIN3编码一个具有C4HC3 (cys4-His-cys3)保守序列结构的PHD-finger蛋白,与二穗短柄草(XP＿003573553.1) VIN3蛋白有很高的相似性。实时荧光定量分析表明,ApVIN3在百子莲茎尖中的表达量受温度调控的影响,其表达量随着低温时间的延长逐渐上升。ApVIN3可能在百子莲成花诱导过程中发挥着重要的作用。     

小麦雄性不育育性转换相关基因TaG3BP的克隆与表达分析

为揭示YS型小麦温敏雄性不育的育性转换基础,以该类型不育系A3017不育幼穗和可育幼穗为材料构建正、反杂交SSH-cDNA文库,从可育文库中筛选出一个与G3BP(Ras-GTPase activating protein SH3 domain-binding protein)基因同源的EST序列(GenBank登录号为DY543200)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据设计引物,在可育幼穗中扩增出一条1230bp的cDNA序列。该片段含有与G3BP相似的由409个氨基酸组成的结构域,与水稻G3BP的氨基酸序列同源性为79%,被命名为TaG3BP(GenBank登录号为GU475149)。利用Real-time PCR检测TaG3BP基因在YS型小麦温敏雄性不育系花药发育各时期中的表达模式,发现该基因在育性转换的关键时期上调表达,且可育条件下的表达量高于同时期不育条件下的表达量。进一步对TaG3BP在3种不同类型的小麦K型雄性不育材料的不育系及其保持系的幼穗中的表达模式进行半定量RT-PCR分析,结果该基因在保持系幼穗中表达量较高,在不育系中表达量较低。表明该基因可能在其育性转换中具有重要作用。     

绣球花花色相关基因HmF3H的克隆及其表达分析

花色是植物重要的观赏性状之一,而黄烷酮羟化酶是植物花色素物质积累的关键酶,对植物花色差异具有重要影响.本研究利用PCR技术从盛花期蓝色花绣球品种'无尽夏'不孕花中克隆获得了HmF3H基因的全长序列,该基因的ORF序列长度为1 095 bp,编码364个氨基酸,编码蛋白的理论分子量为41.08 kD,理论等电点为5.48...     

陆地棉GhSPL3基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

 利用生物信息学结合RT-PCR技术从陆地棉中克隆出SPL转录因子,命名为GhSPL3,在GenBank的登录号为JN795132。该基因包含一个426 bp的ORF(开放阅读框),推测编码141个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSPL3包含一个典型的SBP结构域和一个核定位信号;进化树分析发现,GhSPL3与AtSPL3聚为一组,推测棉花GhSPL3和拟南芥AtSPL3在结构和功能上可能有着一定的相似性。亚细胞定位表明,GhSPL3定位于细胞核中,荧光定量RT-PCR结果表明,GhSPL3基因在棉花各组织中都有表达,但表达量不同。在花中表达量最高,其次是在顶芽和茎中的表达量,在根和叶中表达量较低。通过分析GhSPL3在顶芽的不同发育时期的表达量发现,GhSPL3在三片真叶展平时的顶芽中表达量最高,推测GhSPL3可能在花芽的分化、生长阶段的转变和花器官的形成上起着重要作用。     

香蕉ARF3基因全长克隆及其对枯萎病菌的响应特性分析

ARF3基因属于ARF基因家族的成员,主要功能是参与细胞信号转导、跨膜运输及囊泡转运。本研究根据已获得的基因片段设计4条特异性引物,采用RACE技术克隆获得了香蕉ARF3基因cDNA全长序列,命名为MuARF3。该基因序列全长共1427 bp,开放阅读框长度为1166 bp,共编码338个氨基酸。BLAST结果显示,香蕉ARF3基因全长核苷酸序列与已报道的其它植物ARF3具有69%～74%的相似性,氨基酸序列有81%～93%的相似性。用香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染香蕉根系后,分析得出的结果表明,侵染根系后香蕉ARF3基因的表达量在侵染后12h达到最高,并且随着时间推移逐渐降低。由此说明本研究获得的MuARF3基因对香蕉枯萎病菌4号生理小种侵染具有应急响应,为进一步利用该基因提供参考。     

芜菁黄烷酮3-羟化酶基因的克隆、序列分析及表达

花青素是一类重要的植物次生代谢产物,黄烷酮3-羟化酶（F3H）是花青素生物合成早期阶段的重要催化酶。利用UV-A处理津田芜菁（Tsuda turnip）和赤丸芜菁（Yurugi Akamaru turnip）块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆了BrF3H基因。津田芜菁和赤丸芜菁的F3H基因完全相同。BrF3H的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrF3H与甘蓝型油菜（Brassica napus）F3H-1的同源性为99%。Northern杂交结果显示,UV-A可以诱导BrF3H表达,基因的表达量与处理时间呈相关。     

小麦三雌蕊突变体TaAP1-3基因的克隆及表达分析

为探讨TaAP1-3基因在小麦三雌蕊性状形成中的作用,从小麦三雌蕊近等基因系CM28和CM28TP中克隆得到3个同源基因TaAP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c。通过碱基序列、氨基酸序列、聚类及实时荧光定量分析表明,Ta-AP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c 基因cDNA 序列分别为1210,1208,1199 bp,ORF分别为825,816,855 bp,分别编码274,271,284个氨基酸残基。 TaAP1-3a、TaAP1-3b 和 TaAP1-3c 与中国春 TaAP1-3的核苷酸序列相似度分别为96．02%,93.1%,93.56%,氨基酸序列相似性高达99%,95%,97%,并且与 A 类基因 TaAGL29、OsMADS15、ZAP1、BM8、EnWM8、TaAP1-3聚集到 AP1/SUQA 亚家族 FUL2类群中。实时荧光定量分析表明, TaAP1-3a、TaAP1-3b 和TaAP1-3c在CM28和CM28TP的3个发育时期的小穗中均有表达,但各个时期的表达量有明显差异。 CM28中主要在二棱期-小花分化期表达,CM28TP中主要在雌雄蕊原基分化期表达。试验分析显示,TaAP1-3a、TaAP1-3b和TaAP1-3c可能具有上述A类基因相似的功能,其表达模式可能与小麦三粒/一粒性状形成相关。试验结果为进一步探讨该基因在小麦三雌蕊性状形成过程中的作用奠定了基础。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

N基因标记基因PCR检测方法的建立及其在遗传育种中的应用

烟草的N基因是一个较为有效的抗烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)基因,在抗病育种中发挥着重要的作用。为建立其标记基因PCR检测体系,评估已知目的基因cDNA序列作为分子标记的目的基因辅助育种的可行性,本文依据N基因cDNA序列设计4对扩增范围在150～950bp的不同片段长度引物,并对含有N基因的coker176基因组DNA进行PCR扩增。扩增结果表明,有3对可扩增出特异产物。测序结果表明,有2对引物的扩增产物含有内含子。根据所获得的DNA序列设计出2对用于分子标记辅助育种的引物,并分别对C151、NC89、coker176等11个品种的基因组DNA进行扩增,结果表明在coker176、龙江912、吉烟9号和龙江911品种中有扩增产物,除龙江911外,这一结果与已知的N基因在11个品种的分布相一致,成功建立了N基因PCR检测体系,并证明以cDNA序列设计引物扩增DNA序列的目的基因辅助育种技术完全可行。并对实验中出现的问题进行了研究。     

西伯利亚蓼PsLEA基因的克隆及在NaHCO3胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼叶片cDNA文库中获得的胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)基因的部分序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA),命名为PsLEA(GenBank登录号:FJ478172)。该基因全长686bp,5'非翻译区为102bp,3'非翻译区为131bp,开放读码框为453bp,编码150个氨基酸。荧光定量PCR分析表明:正常情况下PsLEA基因在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中皆有表达,其中茎中表达量最高。3%NaHCO3诱导胁迫下,叶、茎、地下茎中PsLEA表达均受到影响且表达模式存在差异,说明PsLEA基因与西伯利亚蓼的耐盐性相关。