暹罗芽孢杆菌X7抗菌肽的分离纯化及抑菌特性分析

芽孢杆菌在农作物生物防治方面具有重大潜力。本研究以实验室前期分离的暹罗芽孢杆菌X7为材料,采用DEAE-Sephadex A-25层析、Sephadex G-75凝胶层析以及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)相结合的方式分离纯化具有拮抗作用的抗菌肽,并对抗菌肽的抑菌特性和稳定性进行分析。结果表明,暹罗芽孢杆菌X7能产生小分子抑菌物质,经纯化后可获得单一条带,相对分子质量约为20.1 kDa。抑菌物质具有一定的温度稳定性、酸碱稳定性、紫外线稳定性、光照稳定性,对蛋白酶、有机试剂不敏感。研究结果可为暹罗芽孢杆菌X7抗菌肽在农作物生物防治中的应用提供理论依据。     

地衣芽孢杆菌1801的分离鉴定及其活性研究

从泡菜样品中筛选到一株对多种食品腐败指示茵都有抑菌活性的菌株,经初步鉴定为地衣芽孢杆菌1801.用TYG培养基进行发酵培养,其抑菌活性在发酵18 h达到高峰,该茵发酵培养物的抑茵活性对蛋白酶K、热、酸碱较稳定.采用pH3沉淀法可将该茵的活性物质进行初步提取.     

纳豆芽孢杆菌的分离纯化及鉴定

根据纳豆芽孢杆菌耐热耐盐的特征分离纳豆芽孢杆菌菌株.由纳豆粉中分离纯化出1株纳豆菌株,由家庭自制纳豆中分离纯化出5株纳豆菌株,并对这6株纳豆芽孢杆菌的细胞、菌落形态及生理特性进行研究.结果表明,这6株纳豆菌均属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).     

芽孢杆菌LP-3抗菌物质的初分离及抑菌活性测定

内生芽孢杆菌LP-3对多种植物真菌具有抑制作用,为分析其分泌的抗菌物质的抑菌活性,分别采用5种有机溶剂对抑菌物质进行萃取,比较了抗菌粗提物与两种杀菌剂对梨黑斑病菌的抑菌效果,测定了粗提物对9种植物病原菌的毒力,结果表明,甲醇萃取物对梨黑斑病菌的抑制效果最佳,抑菌率可达68.4%,对病菌菌丝及孢子的EC50分别为1.18mg.L-1和3.61mg.L-1,介于腐霉利和异菌脲之间,显示出良好的抑菌活性,而且该物质抗菌谱广,对9种植物病原菌的EC50在1.18mg.L-1～67.93mg.L-1之间。     

多粘类芽孢杆菌S960抑制尖孢镰刀菌的活性物质分离纯化

对多粘类芽孢杆菌S960胞外粗提液采用硫酸铵沉淀法和Sephadex G-75凝胶层析法分离纯化多粘类芽孢杆菌S960释放的活性物质,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测该活性蛋白质的相对分子量、薄层层析法初步鉴定该活性物质。结果表明,40%的硫酸铵沉淀提取效果最佳,Sephadex G-75凝胶层析在控制0.5 mL·min^-1的流速下,洗脱时间为50～70 min的收集液中具有有效活性物质,聚丙烯酰胺凝胶电泳测得该活性物质相对分子量约为66.2 kDa,纯度为91.87%。薄层层析展开结果显示该活性物质可能含有α-氨基酸、苯丙氨酸、羟脯氨酸或脯氨酸。这说明多粘类芽孢杆菌S960可以通过释放具有抑菌活性的蛋白而抑制尖孢镰刀菌的生长。     

1株碱蓬内生芽孢杆菌的分离及抑菌活性测定

为进一步探究内生细菌的生防机制,采用NA固体倾注法培养从碱蓬健康组织中分离的菌株,并对分离菌株的个体形态、菌落特征和生长特性进行初步研究,同时采用平板对峙法对其抑菌活性进行了测定.结果表明:从碱蓬健康组织中分离出1株内生芽孢杆菌(EB0901);该菌的生长最适温度为35℃,初始pH6～8时出现生长高峰,以pH为7时生长最好;在NaCl浓度为0.5%时生长最佳,但在10%以上时仍可生长;对供试的9种植物病原真菌菌丝生长均有一定的抑制作用,对玉米大斑病菌、辣椒菌核病菌、平脐孺孢病菌、辣椒炭疽病菌的抑菌能力较强,抑菌率在60%以上,显著高于其他5种植物病原真菌(P＜0.05),其中,对玉米大斑病菌的抑菌活性最强,抑菌率高达64.11%.碱蓬内生芽孢杆菌是一种具有明显抑菌活性的内生细菌,值得进一步开发利用.     

多粘芽孢杆菌Dw 6菌株培养条件的优化及其发酵液抑菌活性的初步研究

10倍稀释法筛选出最佳产抑菌活性物质的多粘类芽孢杆菌Dw-6菌株,试验表明Dw-6菌株最佳培养基为发酵培养基.利用4因素均匀设计方案进行培养基配方的优选,同时进行培养时间和发酵条件的优化.结果表明,Dw-6菌株优化后的培养基配方为(50 mL)蛋白胨3.83 g、酵母浸出粉3.9 g、MgSO4·7H2O0.105 g、K2 HPO4·3H2O 0.17 g,最佳培养时间48 h,初始pH 7.0,培养温度30℃.经培养基优化后,Dw-6菌株在培养基初始pH 7.0时,30℃培养48 h的发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及出芽短梗霉菌均表现出很强的抑制作用.     

苦楝果实提取物对几种芽孢杆菌的抑菌活性

将采摘的苦楝果实烘干、粉碎后,以甲醇为溶剂,用超声波法提取后,配成不同浓度的苦楝果实提取液,测定其对巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌4种芽孢杆菌的抑菌圈直径和抑菌百分率。结果表明:苦楝果实提取液浓度越高,其抑菌作用越强。苦楝果实提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最大,对短芽孢杆菌的次之,对巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的抑菌活性最小。     

Bacillus velezensis SWUJ1拮抗物质分离纯化及抑菌机理研究

为探究具潜在生物防治作用的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis SWUJ1)菌株的抑菌机理,通过全基因组测序,寻找该菌潜在的抑菌物质合成基因簇,推测可能合成的抑菌活性产物;并通过检测拮抗菌株发酵滤液热稳定性,初步判断抑菌物质类型,进而结合酸沉淀法和液质联用(LC-MS)和高效液相色谱(HPLC)等方法,对菌株发酵液抑菌活性物质进行分离纯化和鉴定,并测定抑菌组分的最低抑菌浓度(MIC),观察其对病原菌生长的影响.全基因组分析结果显示:B.velezensis SWUJ1具有13个次级代谢产物合成基因簇,以非核糖体肽合成酶途径合成的脂肽类抗生素为主;拮抗菌活性发酵滤液具有较好的热稳定性. LC-MS分析结果显示:其活性发酵液提取物中含有脂肽类化合物表面活性素、丰原素和伊枯草菌素;经硅胶柱层析、 HPLC和凝胶柱层析,获得一单峰组分,其MIC为200μg/mL,该组分可使病原菌丝扭曲、畸形、肿大.     

枯草芽孢杆菌BS-1菌株抑菌活性研究

对1株枯草芽孢杆菌BS-1进行了抑菌活性测定研究。以苹果炭疽病菌、番茄灰霉病菌、水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌、辣椒疫霉病原菌、玉米小斑病菌7种植物病原菌为指示菌,采用对峙培养法、杯碟法以及菌丝生长速率法测定了枯草芽孢杆菌及其无菌发酵液对7种植物病原菌的拮抗活性,结果表明,枯草芽孢杆菌及其发酵液对番茄灰霉病菌生长有较强的抑制作用,对苹果炭疽病菌没有抑制作用。     

多黏芽孢杆菌液态发酵条件的初步研究

[目的]优化多黏芽孢杆菌（Paenibacilus polymyxa）液态发酵的条件。[方法]在单因素试验基础上,采用正交试验对多黏芽孢杆菌液态发酵培养条件进行优化。[结果]确定的最佳培养基配方和培养条件为：马铃薯250.0 g/L,白砂糖20.0 g/L,玉米粉30.0 g/L,NaNO3 1.0 g/L,（NH4）2SO4 1.5 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,pH6.5,装液量100 ml/250 ml（V/V）,接种量5%（V/V）,培养温度37℃,摇床转速150 r/min,培养周期72 h。[结论]该研究可为工业化生产多黏芽孢杆菌提供参考。     

三株芽孢杆菌抑菌活性分析及对肉鸡舍空气微生物的影响

【目的】分析2株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和1株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的基本特性以及对大肠埃希氏菌（Escherichia.coli,CVCC1570）的抑制活性;分析3株芽孢杆菌复合制剂对肉鸡舍空气大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用,为改善畜舍环境提供基础数据。【方法】对3株芽孢杆菌进行形态学观察、镜检和生长曲线测定,以大肠埃希氏菌（CVCC1570）为指示菌株,采用琼脂扩散法对单一菌株的抑菌特性进行测定,筛选出适宜的抑菌浓度;利用三因子三水平的正交试验设计,筛选出最佳抑菌效果的复合芽孢杆菌组合;鸡舍喷洒试验采用单因子设计,分为3个处理组,每个处理设3个重复,分别为空白对照组,化学消毒剂阳性对照组（苯扎氯铵）,喷洒复合芽孢杆菌菌剂处理组。在肉鸡不同日龄检测鸡舍内大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的变化规律。【结果】3株芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧菌。芽孢杆菌SKN01和芽孢杆菌SKN02生长曲线相近,在培养2h开始进入对数生长期。芽孢杆菌SKN03生长较缓慢,进入对数生长期的时间相对较长。单一菌株对大肠埃希氏菌有效抑菌浓度均为108CFU•mL-1。经正交试验测定,3株芽孢杆菌复合菌液最佳抑菌组合为4×108 CFU•mL-1、4×108 CFU•mL-1、6×108 CFU•mL-1。最佳组合复合芽孢杆菌喷洒鸡舍,能够有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,在肉鸡生长后期复合制剂的抑菌效果明显。【结论】3株芽孢杆菌能够有效抑制大肠埃希氏菌,同时复合菌液能够有效减少鸡舍有害微生物的数量,起到改善鸡舍环境的作用。     

类芽孢杆菌胞外胆固醇氧化酶的分离纯化

[目的]探讨类芽孢杆菌产生胞外胆固醇氧化酶(COD)的分离、纯化方法,为其生产和应用提供技术支持.[方法]将类芽孢杆菌发酵液通过旋转蒸发浓缩、蔗糖透析浓缩、DEAE离子交换柱层析和凝胶层析,纯化目的蛋白,然后测定获得酶的基本酶学性质.[结果]类芽孢杆菌发酵液经DEAE离子交换柱层析和SephadexG-75凝胶柱层析后,纯化所得的COD比活力达6.83U/mg,酶活力回收为35.6%,纯化倍数为13.4倍.纯化酶经SDS-PAGE显示为均一条带,分子量约58 kDa.将纯化的COD作用于不同浓度胆固醇,采用Lineweaver Burk作图法,测得其Km=3.3×10-5 mol/L.薄层层析结果显示,产物为胆甾-4-烯-3-酮,说明纯化所得酶是COD.[结论]纯化获得电泳纯类的芽孢杆菌胞外COD,其与底物亲和力较强,具有潜在的应用研究价值.     

3株甘蔗内生芽孢杆菌的抑菌促生活性评估

【目的】测试3株甘蔗内生细菌的抗病促生长活性,并确定优良菌株的分类学地位,为后续甘蔗生防菌剂的研究与开发提供理论依据与材料。【方法】以分离自甘蔗栽培种闽糖69-421和滇蔗01-58的3株芽孢杆菌P8、Q2和P7为研究对象,测定其广谱抑菌活性和促生长活性指标;检测菌株的常规生理生化指标,对菌株16S rRNA和GyrA两个看家基因进行测序,采用MEGA软件邻接法对3株菌株进行聚类分析。【结果】3株菌株对串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、烟草炭疽菌(Colletotrichum micotianae Averna)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰孢菌(F. graminearum)、大斑凸脐蠕孢菌(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍离蠕孢菌(Bipolaris maydis)均具有良好的抑制效果。菌株Q2对玉米小斑病菌的抑制效果最好,抑制率达到81.60%,对其余病原菌抑制率也达到61%以上;其嗜铁素合成能力强于P8和P7;其无机磷利用能力强于P8和P7,可溶性磷含量达166.95 mg/L;培养3 d时,Q2的纤维素酶活...     

1株桑叶内生生防多黏类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备及应用效果

以筛选自健康桑树叶片的1株多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)为研究对象,通过单因素试验、正交试验结合生物相容性确定可湿性粉剂的最佳配方,探讨可湿性粉剂的促生效应和安全毒理性,在此基础上探索菌株促生和拮抗机制.结果表明,可湿性粉剂的最佳配方为发酵液70％、载体硅藻土10％、分散剂聚乙烯醇5％、湿润剂十二烷基苯磺酸钠10％、稳定剂磷酸钾2.5％、保护剂糊精2.5％.可湿性粉剂主要性能检测结果显示,菌含量约为7.0×108 CFU/g,悬浮率为92.99％,湿润时间为20 s,细度为96.2％,pH值为6.8,含水量为1.81％.可湿性粉剂热稳定性较好,耐受弱酸弱碱环境.平板对峙试验结果表明,可湿性粉剂对桑青枯病病原菌5号小种和灰霉菌仍有较高的拮抗性能,灌根处理对番茄幼苗有明显促生效果.浸根和茎穿刺处理对番茄幼苗无害;经口灌胃试验小鼠表明可湿性粉剂低毒性,对雄性个体影响较小,对雌性个体的伤害较大.培养基定性分析结果显示菌株可产生铁载体,能产生有机酸、胞外纤维素酶和蛋白酶,从而直接或间接促进植物生长和抑制病原菌的生长.     

棉花立枯病拮抗细菌的分离鉴定及抑菌活性

为获取对棉花立枯病具有生防作用的细菌,从棉田土壤中筛选出1株高效抑制立枯丝核菌的拮抗细菌W1,通过形态学特征结合16S rDNA序列分析鉴定其分类地位,并采用平板对峙法分析其抑菌活性。结果表明,拮抗细菌W1经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,其对立枯丝核菌具有稳定的抑菌作用,发酵原液的抑菌率为82.12%,稀释5倍的无菌发酵液和菌体破碎液抑菌率分别为42.54%和46.15%。抑菌活性受培养基成分影响,BPA培养基的发酵液抑菌率最高,达98.34%,NA培养基抑菌率仅为17.12%。抑菌活性物质在80℃、中性和偏碱性条件下具有稳定性,对蛋白酶K处理不敏感。显微观察发现,菌株W1的主要拮抗机理是通过产生拮抗物质造成病原菌的菌丝消融、菌丝体断裂、扭曲和畸形。结果表明拮抗细菌W1是具有潜在应用前景的防治棉花立枯病及其他植物真菌病害的菌株资源。     

芽孢杆菌抗菌肽调控基因的PCR检测及其抑菌活性

为了快速筛选具有拮抗芽孢杆菌菌株,试验以20株拮抗芽孢杆菌为研究对象,采用PCR对4类芽孢杆菌抗菌脂肽合成酶基因进行检测,并通过不同基因型菌株的抑菌活性测定,评价芽孢杆菌抗菌脂肽的活性。结果表明,Surfactin及Bacilysin这2类合成酶调控基因在20株供试菌株中的检测率均为100%;仅TC-4菌株未检测到Fengycin合成酶调控基因;PG-1、LJ-23、HS-11、LB-2菌株未检测到Iturin合成酶调控基因;LJ-23、LB-2菌株未检测到Bacillomycin D合成酶调控基因;LB-2菌株未检测到Mycosubtilin合成酶调控基因。NTSYS聚类分析结果表明,在0.71分类水平上,20个菌株被划分为3类,其中,Ⅰ类菌株ZSH-2对立枯丝核菌的抑菌率为84.27%,Ⅱ类菌株TC-4对立枯丝核菌的抑菌率为53.42%,Ⅲ类菌株LJ-23对立枯丝核菌的抑菌率仅为18.03%。含有ituB、fenB、bmyB调控基因的菌株抑菌活性较高,可作为筛选高效拮抗芽孢杆菌的条件。     

萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性

【目的】研究萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)XW2胞外蛋白的抑菌活性及其特性,探索植物病害生物防治的新途径。【方法】采用滤纸片法和叶盘法,检测XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度(MIC)和叶盘抑菌活性,以及对该病菌菌丝和孢子萌发的影响;研究其对另外5种植物病原真菌(尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌)的抑菌活性,并分析其抑菌活性在不同的pH(2,3,4,5,6,7,8,9,10和11)、温度(30,40,50,60,70,80,90,100,110和121℃)、蛋白酶(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K)、紫外线作用时间(1,2,3和4h)、金属离子(Li~+、Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ag~+)、表面活性剂(Tween 20和SDS)、抑制剂(EDTA)、氧化剂(H2O2)和常温保存时间(0.5,1,2,3,4,5和6个月)下的稳定性,最后分析XW2产细胞壁裂解酶的特性。【结果】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白对杨树炭疽病菌的最小抑菌浓度为0.01mg/disc(5号滤纸片),能明显抑制杨树炭疽病菌在平板和杨树叶片上的生长,有效抑制孢子的萌发和附着孢的形成,并导致菌丝和萌发芽管产生膨大畸形;对尖孢镰刀菌、金黄壳囊孢、犁头霉、细极链格孢和黑腐皮壳菌均有明显的拮抗活性。XW2胞外蛋白在110℃下处理30min及pH 6.0~9.0下均能保持较高的抑菌活性;对蛋白酶、紫外光照、金属离子(Li~+、Na~+、K~+、Ag~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+))、SDS和EDTA均不敏感,但Mn~(2+)和Fe~(3+)会抑制蛋白的抑菌活性,而Tween 20和H_2O_2则能提高其抑菌活性;在常温条件下保存6个月后,其抑菌活性并未发生明显丧失。细胞壁裂解酶检测发现,XW2能产生蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶。【结论】萎缩芽孢杆菌XW2胞外蛋白的抑菌活性强、稳定性好且抑菌谱广,具有潜在的工业开发和田间应用前景。     

一株具有抑菌活性的凝结芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抗逆性研究

研究采用MRS培养基平板钙溶圈法结合琼脂扩散牛津杯法进行抑菌性能评估,获得一株具有产酸和抑菌活性的芽孢杆菌菌株CA04121。该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有明显抑制作用,在模拟胃液中处理180 min存活率达到72.7%,在0.6%的胆盐溶液中处理6 h存活率达到54.5%。通过形态特征、生理生化特征以及gyrB基因进化分析结果,鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC NO.16244。     

一株具有抑菌活性的凝结芽孢杆菌的筛选、鉴定及其抗逆性研究

研究采用MRS培养基平板钙溶圈法结合琼脂扩散牛津杯法进行抑菌性能评估,获得一株具有产酸和抑菌活性的芽孢杆菌菌株CA04121。该菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有明显抑制作用,在模拟胃液中处理180 min存活率达到72.7%,在0.6%的胆盐溶液中处理6 h存活率达到54.5%。通过形态特征、生理生化特征以及gyrB基因进化分析结果,鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans),该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏编号为CGMCC NO.16244。