中国兰ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化中国兰的ISSR-PCR反应体系,并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物,为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考.[方法]以6个中国兰品种为材料,采集其叶片样品,分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨,比较两种方法提取DNA的效果,利用L25(53)正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化,建立最佳ISSR-PCR反应体系,并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物.[结果]研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法,但二者提取的DNA质量均较好(OD260/OD280为1.7~2.0).对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量.综合考虑成本和DNA模板量,最佳ISSR-PCR反应体系(20.0μL):DNA模板10.0 ng、引物0.8μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0μL.最佳循环数为35,最佳退火温度为49.6℃.基于上述优化结果,从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物.[结论]研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量,且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物,扩增获得的条带清晰、稳定,多样性好,可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究.     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12     

正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系

以莲雾品种‘农科一号’为试材,采用经改良的CTAB法提取莲雾叶片的DNA,探讨了Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq聚合酶、模板DNA含量对莲雾ISSR-PCR的影响。建立了总体积为25μL的莲雾ISSR-PCR反应体系:Mg2+浓度为3.0mmol.L-1﹑dNTP浓度为0.2mmol.L-1﹑primer浓度为0.4μmol.L-1﹑Taq DNA聚合酶1.5U﹑模板DNA含量为30ng,并含2.0μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)。应用该反应体系对‘农科一号’和‘农科二号’进行ISSR-PCR扩增,共筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

浙江红山茶总DNA提取及ISSR-PCR引物筛选

[目的]筛选出简易的DNA提取方法及适合于所有浙江红山茶种质材料进行ISSR分析的有效引物。[方法]采用改良的CTAB法提取基因组DNA,参考其他山茶科植物的50个ISSR引物,对来自浙江、福建、江西、安徽10个居群中共20份浙江红山茶种质材料进行了PCR扩增。[结果]改进的CTAB法可简单、快速地提取到高纯度DNA产物;筛选出的20条引物多态性丰富、条带清晰且可重复性良好。共扩增出337条DNA谱带,其中281条为多态性带,占总扩增带数的83.4%,平均每个引物扩增出16.85条谱带。[结论]所筛选的20条引物可有效应用于浙江红山茶种质资源材料的ISSR分析。     

马褂木ISSR-PCR扩增体系的优化

【目的】建立稳定的马褂木ISSR-PCR扩增体系,为马褂木种群ISSR多样性分析提供技术支持。【方法】采用单因素试验对ISSR-PCR扩增体系中的MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板用量和退火温度等主要因素进行筛选优化。【结果】采用试剂盒方法提取马褂木叶片DNA的效果优于改良CTAB法,最优PCR反应体系为：总体积20.0μL中含有10×Buffer2.0μL、MgCl21.8mmol/L、dNTPs0.2mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.00U、DNA模板60ng、退火温度59.1℃。【结论】优化后的马褂木ISSR-PCR扩增体系能够扩增获得清晰、稳定的条带,可满足马褂木种群ISSR多样性分析的要求。     

薏苡ISSR-PCR扩增体系的优化

采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,测试薏苡ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试Mg2 、dNTP、BSA、引物浓度及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等6个因素对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果显示,10μl PCR反应体积中包括:1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),1.75 mmol/L Mg2 ,0.6 mmol/L dNTP,1 mg/ml BSA,10 ng模板DNA,20 pmol引物,0.45 UTaq酶。     

大明竹属部分植物ISSR-PCR反应体系优化及有效引物筛选

采用单因素试验方法,建立了适合大明竹属25个竹种的ISSR-PCR反应体系,优化了各影响因子的用量,筛选出18条有效引物,并确定它们的退火温度,最后对体系进行了检验.优化后大明竹属植物ISSR-PCR的20 μL反应体系含2.0 μL10×PCR Buffer、2.5 mmol·L-1 Mg2＋、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.5 μmol·L-1引物、1.0 U Tap DNA聚合酶、50 ng模板DNA、10.6μL灭菌ddH2O.扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性60 s,55℃复性45s,72℃延伸90 s,循环40次;72℃延伸7min,4℃保存.该ISSR-PCR反应体系可用于大明竹属部分植物的遗传多样性及遗传结构研究.     

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（摘要）（英文）

[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium（Linn.） Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为：DNA浓度（ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（DNA量/所用叶片量×100%）。对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素（DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 ＋和dNTPs）逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。最佳扩增程序为：94℃预变性5min,然后进行40个循环：94℃变性30 s,50 ～60℃退火（退火温度随引物不同而定） 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。     

Optimization of ISSR-PCR system in licorice

甘草是中国最大宗的药材之一,具有重要的药用、生态及工业价值。利用ISSR技术对甘草种质资源的遗传多样性进行深入研究,对甘草物种生物多样性的保护及新品种培育具有重要意义。研究了影响甘草ISSR-PCR扩增效果的一些因素,实验结果表明:最适宜用于甘草ISSR PCR分析的反应条件为:20μl反应体系中,1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液(10mmol/LTris-HCL,pH9.0,50mmol/LKCL,0.1%TritonX_100,2.0mmol/LMg2 ),0.8UnitTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,200μmol/LdNTP,10ng模板DNA。     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化

以番茄(Lycopersicon esculentum)基因组DNA为模板,对番茄ISSR-PCR反应体系的Mg2 、dNTPs、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度进行了探讨,确立了适合番茄植物ISSR分析技术体系,为番茄植物遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

甘薯ISSR-PCR反应体系的优化

为进一步利用ISSR-PCR标记技术研究甘薯种质资源的遗传多样性,针对影响ISSR-PCR反应体系的5个影响因子(模板、甲酰胺、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶)进行了甘薯ISSR-PCR体系优化的正交试验设计研究.结果表明,处理10为比较好的组合,即在20 μL的反应体系中,含稀释浓度为10倍的DNA模板,0.30 mmol/L dNTP,1.00 μmol/L引物,1.00 UTaq酶,0.5%去离子甲酰胺比较适合甘薯DNA的特异扩增.     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

为应用ISSR分子标记对黄皮种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究,通过单因素和正交试验对ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明,采用改良SDS法提取的DNA条带完整、无RNA污染,适于ISSR-PCR扩增;黄皮ISSR分析最适的扩增体系是:20 μl的反应体系中含30ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、0.3 mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为520.4℃.     

迎红杜鹃ISSR-PCR反应体系建立

利用正交设计L16(45)方法对迎红杜鹃(Rhododendron mucronulatum Turcz.)ISSR-PCR(Inter-simple sequence repeat-Polymerase chain reaction products)反应体系的5因素(TaqDNA聚合酶、Mg2+、DNA模板、dNTP、引物)在4个水平上进行了优化试验。结果表明,ISSR-PCR反应体系各因素在设定的不同水平对PCR反应结果都有影响,其中引物浓度的影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立的迎红杜鹃ISSR-PCR反应最佳体系(25μL)为2.0μL10×Buffer、0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)、2μLDNA模板(20ng/μL),2.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、2μL引物(10μmol/L)。     

兜兰属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以兜兰为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,采用正交试验设计,分析Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR扩增的影响,并通过梯度PCR确定最佳退火温度,最终建立兜兰ISSR扩增反应体系。最佳反应体系为:25μL体系中,含10×PCR buffer 2.5μL、1.5mmol/L Mg2+、0.15mmol/L dNTP、0.6μmol/L引物、1.0 UTaq酶和40 ng模板DNA。反应程序为:94℃5 min,94℃30 s,56.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃延伸7 min。     

丝瓜ISSR-PCR反应体系的优化

以丝瓜为研究材料,通过单因素试验结合正交设计研究ISSR-PCR反应的影响因素,建立反应体系.结果表明;在20 μL的反应体系中,含2.0 μL 10×buffer,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.25 mmol·L-1dNTPs,0.35 μmol·L-1引物,30 ng模板DNA,为丝瓜ISSR-PCR分析的最...     

东南石栎ISSR-PCR反应体系的优化

为了利用ISSR分子标记进行东南石栎(Lithocarpus harlandii)种群遗传多样性分析,获得重复性和可靠性较高的ISSR带谱,有必要对其影响因素进行优化.以东南石栎基因组DNA为研究对象,测试东南石栎ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,对影响PCR扩增效果的一些因素,如Mg2 浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、BSA浓度、Taq DNA聚合酶用量等6个因素进行筛选和优化,最终确立了可用于东南石栎ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应条件:10μL PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(200 mmol·L-1Tris-HCl,pH值8.8,100mmol·L-1 KCl,1%Triton X-100),0.5U Taq DNA聚合酶,2.25 mmol·L-1MgCl2,0.5 mmol·L-1 4×dNTP,6pmol引物,2 mg·mL-1BSA,10 ng模板DNA.在此最适条件下,比较了降落PCR的扩增结果与最适退火温度条件下的PCR扩增结果的差异,确定了最适的ISSR扩增程序:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,57℃退火1 min(每个循环降低0.5℃),72℃延伸1.5 min,共10个循环;94℃变性1 min,52℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,共25个循环;72℃延伸5 min.以此条件采用12个引物对千岛湖的东南石栎居群进行扩增,共扩增出174个DNA片段,多态位点百分率为81.61%,种群内遗传多样性处于较高水平.     

茶树ISSR-PCR反应体系优化研究

通过优化影响茶树ISSR PCR的主要参数,确立适合于茶树的ISSR反应体系和扩增条件。结果表明,在20μl反应体系中模板DNA的用量、T aq酶用量、引物浓度、M g2 浓度、dNT p浓度分别为:模板DNA为40 ng;T aq酶为0.5 U;引物为0.25μm o.lL-1;M gC l2为1.5 mm o.lL-1;dNT p为0.2 mm o.lL-1。适宜退火温度比Tm值高2~3℃。     

五节芒ISSR-PCR反应体系的优化

［目的］保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。[方法]以五节芒DNA为材料,分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。［结果］建立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、0.2 mmol/L 4×dNTP、1.5 mmol/L Mg^2＋、0.75 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s;51-53 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,40个循环;72 ℃再延伸7 min。利用优化反应体系从100个ISSR通用引物中筛选出了11个稳定性高、重复性好的引物。［结论］这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。