我国部分地区牛轮状病毒的病原学调查及一株G10P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定

应用轮状病毒RNA电泳方法,对内蒙古、黑龙江、新疆、北京、安徽等地共90份犊牛腹泻粪便样品进行检测.在内蒙古和新疆采集的粪样中共检出11份轮状病毒阳性样品,平均阳性率为12%(11/90).阳性样品经RT-PCR分型鉴定,新疆2份和内蒙古5份样品属于G10型,新疆另一牛场的4份样品属于G6型.对所有阳性样品进行病毒分离,获得1株能在MA104细胞上稳定传代的病毒株,经鉴定该分离株属于G10P[11]型轮状病毒,命名为HM26.G10型牛轮状病毒的分离在国内尚属首次.     

黑龙江省大庆市部分地区牛轮状病毒腹泻的分子流行病学调查

为了对黑龙江省大庆市部分地区犊牛轮状病毒腹泻的流行情况进行调查,应用RT-PCR技术对随机采取的6份犊牛腹泻粪便样品的轮状病毒VP7基因进行扩增,采用多重半套式PCR方法对VP7基因阳性样本进行分型鉴定。结果显示,6份犊牛腹泻粪便样品中牛轮状病毒VP7基因均为阳性;VP7基因阳性样本经RT-PCR分型鉴定,均属于G10型。该研究结果表明大庆地区引起犊牛轮状病毒腹泻的轮状病毒主要为G型,因此需要针对G型轮状病毒加以防控。     

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】 试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】 采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验（IFA）和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】 抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应（CPE）。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066（LC367318.1）相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2（MN937506.1）相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】 试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。     

G8P[1]型牛轮状病毒的分离鉴定及序列分析

为了对大庆地区患有腹泻疾病的舍饲牛进行病原鉴定,通过RT-PCR方法对病料进行检测,将轮状病毒阳性样品接种MA104细胞进行病毒分离,扩增分离株VP7、VP4片段,将扩增产物纯化后连接在pMD18-T载体上,转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中进行亚克隆,将鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,并利用DNA Star与GenBank上的参考序列进行同源性分析。结果表明,从样品中分离到1株BRV毒株,将其命名NX23。核苷酸序列分析表明,分离株NX23属于G8P[1]型轮状病毒,确认了G8P[1]型牛轮状病毒在我国的流行,为我国BRV分子进化及其RV分子流行病学的进一步研究奠定基础。     

中国不同地区猪轮状病毒的分离鉴定及分子流行病学分析

为鉴定国内不同地区猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRo V)并分析其分子流行病学特征,本研究将从我国不同地区收集病料中检测到的16份PRoV阳性仔猪粪便样品和小肠内容物处理后接种MA-104细胞,传代后进行荧光定量PCR (qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定,并经电镜观察。结果显示,其中7份样品F1～F3代病毒液qPCR Ct值均随着传代次数的升高而逐渐降低,IFA鉴定结果显示均能在细胞中观察到特异性荧光,电镜观察到直径约70 nm无囊膜的病毒粒子,表明本实验分离到7株PRoV。利用RT-PCR扩增7株分离株和其余9份PRoV的阳性样品的VP7基因并测序分析基因型,基于VP7基因进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16份阳性样品包含3种G型,即G9(7/16)、G4 (6/16)和G3 (3/16),同时G9型FJ-2021分离株和G4型JS01-2021分离株与近两年流行株亲缘关系较近。统计16份样品中G型PRoV的地域分布,结果显示华东地区有G9、G4和G3型的流行,四川有G3和G9型流行,广东有G9型的流行,分别与华东地区、四川地区和广西地区报道的流行G...     

一株牦牛源G6P[11]型牛轮状病毒的分离鉴定及部分基因的序列分析

本研究的目的是分离、鉴定牦牛源牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)。将经RT-PCR检测BRV阳性的牦牛腹泻粪便样本接种MA-104细胞,进行病毒分离和鉴定,并对其VP4、VP6和VP7完整基因进行测序,分析其分子特征。结果显示:病毒盲传3代后出现细胞病变,至第7代后出现细胞病变的时间稳定,经蚀斑纯化后测得病毒滴度为10^8.39TCID₅₀·mL^-1。分离株经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察证实为BRV,命名为HY-1株;扩增HY-1株VP4、VP6和VP7完整基因序列,分析表明HY-1株为G6P[11]I2型;系统发育树显示,HY-1株VP4、VP6和VP7节段分别与中国牛源DQ-75株和印度牛源M-1和RUBV319株遗传演化关系最近,可能为重配毒株。与国内的G6型和P[11]型BRV毒株相比,HY-1株的VP4和VP7蛋白重要氨基酸位点变化较大。成功分离得到一株牦牛源BRV,基因型为G6P[11]型,为我国首次报道。     

新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒,(CHLY)并以其感染的MA-104为试验材料,较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察,并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定,鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒,直径在60~70 nm之间,病毒粒子由双层衣壳包裹,呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高,核苷酸同源性为98.9%,结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。     

新分离牛轮状病毒及其血清型的研究

从爆发犊牛腹泻的牛群中分离到一株轮状病毒,（CHLY）并以其感染的MA-104为试验材料,较为系统的对轮状病毒的形态结构及其宿主的超微病变进行了观察,并将其主要保护性抗原VP7基因克隆入pUCm-T载体进行序列分析及测定,鉴定其血清型。轮状病毒粒子为圆形颗粒,直径在60-70nm之间,病毒粒子由双层衣壳包裹,呈典型的轮状病毒车轮状结构。在轮状病毒感染的细胞质中,可观察到处于不同发育阶段的子代病毒粒子。对轮状病毒的中和抗原VP7的序列分析结果表明CHLY与G6血清型轮状病毒RF株同源性最高,核苷酸同源性为98．9％,结果表明分离的轮状病毒CHLY株为G6型轮状病毒。     

猪轮状病毒江西株AY01的分离鉴定

【目的】确定江西省某猪场哺乳仔猪发生腹泻的病因。【方法】对送检的仔猪小肠样品进行猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)的RT-PCR检测,将阳性样品接种MA104细胞传代进行PoRV的分离;对分离毒株进行电镜观察、间接免疫荧光试验、PoRV VP4和VP7基因序列测序和动物回归等试验。【结果】猪小肠病料样品经终浓度15 μg/mL的胰酶处理37 ℃孵育2 h,接种MA104细胞,能在细胞上增殖传代,第6代开始表现稳定的细胞病变;电镜观察可见病毒粒子直径大小为61~70 nm,平均大小为65 nm,呈带有短纤突且外缘光滑的形似车轮状的粒子,具有轮状病毒粒子典型的形态特征;间接免疫荧光试验和RT-PCR检测均为PoRV阳性,确定该分离株为PoRV。分离株VP4和VP7基因序列分析显示,VP4基因型与P[23]基因型相似性最高,VP7基因型与G5基因型相似性最高,根据A群轮状病毒最新分类方法,分离株属于G5P[23]型。动物回归试验结果显示,经口感染该分离株的1日龄初生仔猪于感染后24 h左右陆续出现水样腹泻、呕吐等临床症状,并能在粪便中检测到PoRV。【结论】通过MA104细胞连续传代,从江西某猪场的腹泻仔猪小肠样品成功分离到1株PoRV,该分离株属于G5P[23]型PoRV,为哺乳仔猪发生腹泻的病原。     

仔猪感染猪轮状病毒的鉴定及基因分析

为弄清2013年年初上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因,本研究随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份,利用RT-PCR方法对采集样品进行病原检测。结果显示,9份临床样品中有4份为猪轮状病毒阳性,而猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。根据GenBank公布的猪轮状病毒参考株序列设计两对引物,对其中阳性样品的VP6和VP7基因进行RT-PCR扩增、基因克隆和序列测定分析。结果显示,4份阳性样品的VP6基因大小为1356 bp,VP7基因大小为1100 bp;序列分析结果显示,VP6基因与A群代表株OSU的氨基酸同源性为64.1%~87.0%,与代表株Gottfriend的氨基酸同源性为26.3%~60.8%;VP7基因与不同G型代表株的氨基酸同源性为71.8%~97.3%。根据上述结果分析,我们推测引起此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的猪轮状病毒引起,本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。     

一株猪轮状病毒的分离与鉴定

将1份经RT-PCR检测猪轮状病毒阳性的临床腹泻粪样感染Vero细胞,连续盲传8代,出现病变,成功分离到1株病毒,经RT-PCR检验和电镜观察,鉴定该病毒为轮状病毒,命名为GD-01-2015。扩增该病毒的VP4和VP7基因进行分型和系统进化分析,结果发现,其VP4基因为P[7]型,与来自韩国的猪源毒株K71同源性达到99.8%;其VP7基因为G5型,与来自韩国的猪源毒株06-6-1同源性达到99.7%。由此可以推测GD-01-2015株与韩国猪源毒株有相似的进化来源。根据轮状病毒分类委员会(RCWG)提出的A群轮状病毒的最新分类方法,GD-01-2015株基因型为G5P[7]。本研究为监测轮状病毒的流行状况及其疫苗的研制提供了理论依据。     

一株G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。     

猪轮状病毒的分离鉴定和全基因组序列分析

为了解广东省规模化猪场中猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的基因特征，本试验在广东省某猪场采集腹泻仔猪肠道组织样品，经实时荧光定量PCR(qPCR)进行病毒初步鉴定；分离获得病毒后，通过间接免疫荧光、电镜观察进一步鉴定，并对分离毒株进行全基因组高通量测序和遗传进化分析。结果显示，qPCR初步鉴定该腹泻仔猪病料为PoRV感染，从阳性病料中分离获得1株能引起典型细胞病变的毒株，在电镜下可观察到似车轮状的病毒颗粒，在倒置荧光显微镜下观察有绿色荧光，将该PoRV分离毒株命名为GD2022,其完整基因型为G9-P[23]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1;基因遗传进化分析结果显示，GD2022为人轮状病毒、猪轮状病毒和狗轮状病毒基因组重组后的毒株。本试验结果丰富了PoRV基因组学和分子流行病学相关的研究资料，为轮状病毒防控提供了数据支持。     

猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定

轮状病毒是引起幼龄动物和儿童病毒性腹泻的主要病原,轮状病毒的分离鉴定为该病的流行病学调查和分子生物学特性研究奠定了基础。本研究采集北京某猪场腹泻发病仔猪肠内容物,将其接种MA104细胞,分离得到一株能产生明显细胞病变的病毒。对分离毒株进行胶体金、实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光等方法鉴定,并对分离毒株的VP4、VP6和VP7基因进行测序及序列分析。结果表明,分离毒株为猪A群轮状病毒。按照A群轮状病毒的最新分类方法,确定该分离株VP4、VP6和VP7基因的基因型分别为P[13]型、I5型和G11型。因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/BJ/2015/G11P[13]。     

Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

为了解内蒙古呼和浩特部分地区牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的流行情况,本研究采用RTPCR技术从采集自内蒙古某屠宰场的32份牛肺脏样品中检测出两株BVDV,命名为BVDV-HT1704、BVDV-HT1723株。通过在MDBK细胞上传代、免疫荧光试验、5’-UTR基因序列测定及分子进化分析对检测出BVDV阳性的肺脏组织进行鉴定。结果显示:在MDBK细胞中盲传10代后没有病变产生;经IFA检测,在病毒感染的细胞浆内产生特异性荧光;序列同源性和系统进化分析表明该毒株属于BVDV-Ⅱa型,且两株分离株属于单一的分支。本研究首次在我国正常牛肺脏组织中分离到BVDV,为了解BVDV在内蒙古自治区的流行情况及地理分布提供依据,并为相关疫苗的研发奠定了基础。     

猪轮状病毒的分离与鉴定

将疑似感染猪轮状病毒的内蒙古某猪场的腹泻仔猪粪便样品在MA104细胞上分离培养,得到一株能产生明显细胞病变的毒株(命名为PRV L1株).经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示该PRV L1株能被猪轮状病毒单特异性血清中和,并可被猪轮状病毒单克隆抗体识别,其VP7基因序列与G5型猪轮状病毒VP7基因序列同源性为99％.动物回归试验结果表明,该毒株口服攻击3日龄仔猪,可引起典型的猪轮状病毒病发病症状,并能在发病仔猪小肠内容物中检测到猪轮状病毒.     

猪轮状病毒Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/G9P[23]株的分离与鉴定

A群轮状病毒(GAR)是引起人类和多种动物腹泻的主要病原体,病原的分离与鉴定是轮状病毒(RV)流行病学、病原学等研究的基础.本研究采用接种MA 104细胞的方法,从内蒙古某猪场患病猪腹泻粪便中分离一株病毒,经3次蚀斑克隆纯化后,采用电镜观察、PCR鉴定和序列测定进行分析,结果表明该分离株为猪轮状病毒(PoRV).致病性试验表明该分离株能够引起仔猪急性腹泻,RT-PCR扩增其VP4、VP6和VP7的基因节段并进行序列测定,按照A群RV的最新分类方法,确定该分离株的VP6、VP7和VP4基因型分别为I5型、G9型和P[23]型.因此,将该分离株命名为Rotavirus A pig/China/NMTL/2009/Q9P[23].     

牛病毒性腹泻病毒BVDV-LC株的分离与鉴定

为分离鉴定新疆地区牛病毒性腹泻病毒(BVDV)流行株,本研究通过RT-PCR检测、细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测、核苷酸序列测定及生物信息学分析对新疆某奶牛场采集的腹泻牛粪便样品进行了病毒分离和鉴定。结果显示,分离得到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-LC株。该病毒株在MDBK细胞培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N~(pro) PCR扩增为阳性,扩增片段与预期大小一致;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10~(5.6) TCID_(50)/0.1 mL;遗传进化分析显示,该分离株与猪源BVDV-SD0803株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-1q基因亚型。本研究表明BVDV-LC株的分离鉴定对进一步开展疫苗研发、牛病毒性腹泻致病机理等方面的研究具有重要意义。     

3株牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其基因分型

为确定牛呼吸道传染病的病原以及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)在临床健康牛群中是否存在持续性感染,本研究采集了内蒙古自治区和黑龙江省两个牛场牛鼻拭子46份及肺脏样品8份,采用MDBK细胞进行病毒分离培养,经BVDV特异性引物RT-PCR检测有3份样品为阳性。利用间接免疫荧光检测3株阳性样品,可以观察到特异性荧光,表明分离得到3株BVDV,分别命名为480、A0583和Lung-6。进一步研究显示480、A0583和Lung-6均为非致细胞病变型。对3株分离病毒的5'端非编码区和Npro基因进化树分析显示3株病毒均属于BVDV1型,其中480株属于BVDV1c亚型,A0583株和Lung-6株同属于BVDV1m亚型。本研究首次在国内同一个牛场分离到BVDV1m(A0583)和BVDV1c(480)两个基因亚型。本研究为我国BVDV-1型不同基因亚型的抗原关系分析及BVDV疫苗的研制奠定了基础。     

G群轮状病毒鸽群分离株的全基因分析

为分析鸽轮状病毒中国分离株的特性,采用高通量测序方法,测定从山东省青岛市某活禽交易市场采集的肉鸽粪便样品中分离的轮状病毒基因组,并对其进行特性分析与比较基因组研究。结果显示,G群轮状病毒鸽群分离株全基因包含11个节段,总长度为17 803 bp,具有与其他轮状病毒相似的结构和基因顺序。与24株轮状病毒代表性毒株的VP6氨基酸序列进化分析结果,以及其他5个结构蛋白氨基酸序列遗传进化分析结果均证实,该病毒属G群轮状病毒。该毒株与2011年从香港鸽群中分离的G群轮状病毒同源性最高,但衣壳糖蛋白VP7的氨基酸序列同源性仅为71.7%,抗原性存在较大差异。