猪瘟病毒C株重组标记疫苗的构建

利用构建的猪瘟病毒C株感染性克隆作为骨架,利用猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因作为标记基因,将GP5基因引入猪瘟病毒感染性cDNA中,体外转录得到RNA,转染SK6细胞后,检测了传代细胞中重组猪瘟病毒包含GP5区段的一段重组序列。结果表明,GP5基因稳定地插入在重组病毒基因组中,改造后的重组病毒可望作为C株活病毒标记疫苗。     

中药制剂SHY对新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒的抑制和攻毒保护效果

本试验利用蔷薇科植物提取物（SHY）分别与新城疫、禽流感H9、H5亚型病毒作用后,接种10 d SPF鸡胚,评价SHY对病毒的抑制作用;给21 d SPF鸡连续口服该中药提取物5 d后,分别用新城疫、禽流感病毒攻击,观察对SPF鸡的保护作用.结果表明：SHY测试剂量对SPF鸡胚没有毒性;20、10、5和2.5 mg/mL提取物与一定量的新城疫、禽流感H9亚型病毒作用后,鸡胚全部存活,病毒测定为阴性;与禽流感H5亚型病毒作用后,2.5 mg/mL组不能完全保护鸡胚存活（6/8）,病毒分离阳性.在攻毒试验中,SPF鸡分别按60、50、40和20 mg口服后,用新城疫和禽流感H9亚型攻毒保护分别为5/5、5/5、5/5和4/5.显示SHY不但能显著抑制新城疫、禽流感H9和H5亚型在鸡胚上增殖,而且能保护新城疫、禽流感H9亚型病毒的攻击.对SHY深入的研究,有望开发出有效抗禽流感药物.     

HA基因138位点突变提高H5亚型禽流感疫苗候选株在鸡胚中的繁殖能力

目前,H5亚型禽流感疫苗的大规模生产仍使用鸡胚培养的重组病毒灭活疫苗.为加深对重组病毒在鸡胚中繁殖适应性分子机制的理解,并获得在鸡胚中的高产疫苗候选株,以反向遗传技术构建了H5亚型禽流感疫苗候选株SF/H5N1,并在鸡胚尿囊腔中连续传代.同时对第1、6、7和10代病毒的全基因组序列进行了分析和发生点突变片段的结构模拟.结果均表明,HA片段138位丙氨酸(A)向丝氨酸(S)的突变与重组病毒SF/H5N1在鸡胚传代过程中繁殖性能升高相关.对不同来源重组病毒LF/H5N1进行A138S突变,产生了相似的效果.并且,A138S突变未明显改变重组病毒的抗原性和对鸡胚的致病力.因此,A138S突变对H5亚型禽流感疫苗候选株的鸡胚适应性具有重要影响,在疫苗生产中具有应用价值.     

慢病毒介导多短发卡RNA串联载体构建与体内外抗口蹄疫效果评估

【目的】探讨应用多短发卡RNA(shRNA)串联沉默口蹄疫病毒RNA复制的可行性.【方法】针对口蹄疫病毒(Foot and mouth disease,FMDV)非结构蛋白基因3B和3D保守区域设计合成3个shRNA的串联片段,并分别用3个不同序列的启动子引导,成功构建了3shRNA串联的慢病毒RNAi载体.利用慢病毒3质粒包装系统共转于293T细胞包装成慢病毒颗粒.利用包装的慢病毒处理细胞及乳鼠,并接种FMDV,观察FMDV抑制情况.【结果和结论】结果显示,慢病毒处理BHK-21获得的转基因细胞中检测shRNA表达;通过O型FMDV接种发现转基因细胞对口蹄疫病毒的复制有明显的抑制,其中在接种后24 h病毒拷贝量仅为普通细胞的1/3;O型FMDV毒株接种于抗口蹄疫慢病毒载体预处理过的3~5日龄乳鼠,在5 LD50滴度下全部乳鼠均存活,在20 LD50滴度下存活率也提高50%.构建的慢病毒介导多shRNA串联表达抗口蹄疫载体能提高BHK-21细胞和乳鼠对口蹄疫病毒的抵抗力,有效地避免了5 LD50滴度内乳鼠的死亡现象,具有抵抗口蹄疫病毒毒性的良好性能.     

利用小RNA深度测序快速鉴定草莓病毒

病毒侵染直接影响草莓的生长发育及果实品质,快速检测及鉴定病毒是病毒防治的前提。本研究以‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓为试材,利用小RNA(sRNA)测序结合RT-PCR技术对2种栽培草莓品种中存在的病毒进行了研究。对sRNA测序结果进行组装和注释,结果表明:在混合样品中共有242个contigs比对到5种草莓病毒,分别为草莓白化病毒(strawberry pallidosis associated virus,SPaV)、草莓镶脉病毒(strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、草莓毛形病毒3(strawberry crinivirus 3,SCrV 3)和草莓毛形病毒4(strawberry crinivirus 4,SCrV 4)。利用RT-PCR技术对sRNA测序结果进行验证,结果表明:SMoV、SVBV和SCrV 3在‘丰香’草莓和‘哈尼’草莓中均检测到,而SPaV和SCrV 4只在‘哈尼’草莓样品中检测到。本研究利用sRNA测序技术鉴定了2个草莓品种中存在的病毒,首次在我国生产的同一个草莓品种中检测到5种病毒,为草莓病毒的检测和防控提供了新的思路。     

5株传染性支气管炎病毒分离株的鉴定和血清分型

从四川、重庆和广东3个不同地区,不同时间发病的肉鸡中分离出5株病毒．通过鸡胚发育试验、NDV干扰试验、动物回归试验和感染后鸡血清中抗体水平变化确定这5株病毒均为传染性支气管炎病毒．血清中和试验表明,这5株病毒血清型与北京分离的A2株一致,而与H52、H120、M41、T和Holte株不同．该研究结果证实了鸡传染性支气管炎病毒类4／91毒株在我国华南和西南地区的流行．     

黑龙江省分蘖洋葱病毒病原的初步鉴定

黑龙江省分蘖洋葱病毒病发生普遍 ,阿城、宾县、五常的发病率均为 10 0 % ,病情指数分别为6 2 .13% ,71.0 7%和 4 9.87%。典型症状为黄化条纹花叶 ,叶片扭曲畸形、叶尖干枯 ,植株矮缩 ,鳞茎退化变小 ,产量和品质大幅度下降。被分蘖洋葱病毒系统感染的有洋葱、大葱、大蒜和蚕豆 ,局部感染的有千日红、苋色藜。电镜观察表明 ,病体细胞中含有大量线状病毒粒体 ,长度在 30 0～ 14 5 0 nm。通过叶片超薄切片 ,在叶肉细胞质中观察到大量的风轮状、束状、涡轮状和环状内含体 ,叶绿体被破坏。体外抗性测定结果表明 ,致死温度为 5 5～ 6 5℃ ,稀释限点为 10 - 4,体外保毒期为 3d。酶联免疫测试和洋葱黄矮病毒抗血清、韭葱黄条纹病毒抗血清、大蒜复合病毒抗血清呈阳性反应。以上特征证明 ,黑龙江省分蘖洋葱病毒病为几种病毒复合侵染 ,初步鉴定为洋葱黄矮病毒和韭葱黄条纹病毒。     

洛阳市马铃薯二季作区病毒侵袭状况调查

利用双抗体夹心酶免疫吸附测定法对洛阳市马铃薯二季作区 ,受PVX、PVY、PVS、PVM及PLRV等病毒侵袭状况进行了调查。结果表明 ,在洛阳市马铃薯二季作区有 5 4 .6 7%的马铃薯植株感染有以上 5种病毒 ,它们大多数表现为单独侵染 ,占感毒株的 6 8.2 9%。而感毒株中 31.71%的群体是由两种以上病毒协同作用而引起的复合感染。PVY、PVX、PVS、PLRV和PVM 5种常见病毒的发生频率依次为 2 6 .33% ,2 5 .0 0 % ,12 .0 0 % ,9.6 7%和 4 .33%。     

含FMDV 2A序列PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒的构建与鉴定

【目的】构建表达PRRSV GP5和M蛋白、且二者通过口蹄疫病毒(FMDV)2A序列连接的重组腺病毒,以期实现2个蛋白的同时表达,发挥GP5蛋白的病毒中和优势和M蛋白的细胞免疫优势作用。【方法】利用RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot等方法,对获得的重组腺病毒(rAd-GP5-2A-M)进行检测。【结果】检测结果均证明,GP5-2A-M蛋白不仅获得了正确表达,而且能自我裂解为GP5和M蛋白。【结论】在GP5和M蛋白之间插入具有自我裂解功能的FMDV 2A策略是切实可行的,并为PRRSV多个蛋白的共表达奠定了基础,也为其他病毒基因工程疫苗的研制提供了全新思路。     

凤尾菇病毒性质的研究

感染病毒的凤尾菇菌丝体外观和生长无异常现象。但子实体出现畸型,产量降低。用聚乙二醇沉淀病毒粒子,经磷钨酸负染,在电子显微镜下放大170000倍,可观察到30nm的球形病毒颗粒。用酚和氮仿提取病毒核酸,再经SDS不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染,可观察到5条特征性核酸节段。病毒核酸对DNase不敏感,热变性后呈增色效应,能被RNase降解,高盐浓度下抗RNase。结果表明,凤尾菇病毒为双链RNA病毒。含病毒的菌丝体经高温处理,挑取菌丝生长尖端,未能消除病毒。     

防禽流感注意鸭子

美国和中国研究人员的最新研究报告指出．禽流感病毒在鸭子身上变异之后．将更具致命性．必须对此采取控制和防范措施。中美两国研究人员通过试验发现．H5N1高致病性禽流感病毒一直在不断变异．尤其是一些看上去健康的鸭子身上隐藏的H5N1病毒，这种病毒正变得对老鼠等哺乳动物更具致命性．而老鼠对人类对禽流感病毒的反应较为接近。     

兔出血症病毒形态学的研究

用氯仿抽提、PEG沉淀、Scpharosc 4B柱层析、超离及蔗糖密度梯度离心等方法纯化了兔出血症病毒。电镜下观察到兔出血症病毒粒子为无囊膜,大小为32～34nm。外观呈现独特的结构。正二十面体对称,髓蕊直径15～17nm,衣壳厚8～9nm。由内、外衣壳组成。外衣壳上按T=3排列着32个壳粒,壳粒呈中空的管状,长5～6nm,直径约4～5nm。中心孔径约2nm。有一环状呈不连续的内衣壳,厚2～3nm,内环上不连续每段约4nm,与壳粒相连。在5、3和2次轴对称时,病毒表面有大的、3个以上特征性的表面凹陷(Surfacc dcpression),这种表面凹陷呈一定的分布。呈五次轴对称时,病毒表周有10个向外管状突起。病毒表周不规则,表面含丰富的突起和大、小的凹陷(dcpression and small indentation)是兔出血症病毒形态学特点之一,其大小和形态,在动物病毒中比较类似于嵌杯样病毒。     

秋冬季口蹄疫病毒的消毒技术

口蹄疫病毒属于单股RNA病毒,对外界环境和一般消毒约抵抗力较强,酚、洒精、氯仿等消毒药对此病毒不起作用,在自然情况下,含病毒的组织和污染的饲料、器具、皮毛及土壤可保持传染数周至数月.用50%甘油生理盐水5℃处理可保持病毒1年以上.     

麻鸡疫病病原的分离与鉴定

通过对致麻鸡发病的病毒毒株的分离,经电镜观察、血液凝集试验、病毒中和试验、动物回归试验、鸡胚接种试验等结果表明,病毒粒子呈球形,表面有囊膜,直径100~450 nm,能凝集鸡红细胞,血凝反应能被新城疫标准阳性血清抑制,能致4周龄鸡发病死亡,MDT为38.2 h,ICPI为1.68,IVPI为2.33。病毒对氯仿、胰酶及酸敏感,能被二价镁离子保护,在4℃放置30 min,其感染力无影响,但对热敏感。以上试验结果表明,病毒为新城疫强毒株。     

利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。     

北疆辣椒病毒病毒原类型初步鉴定

1989—1992年从乌鲁木齐、昌吉、阜康、石河子等地采得的98株病毒病株,初步归为5个类型。经寄主范围、体外抗性,传播途径测定,病毒颗粒形态观察及血清反应,初步确认此5个病毒类型分属于烟草花叶病毒类群,黄瓜花叶病毒类群、马铃薯X病毒类群、马铃薯Y病毒类群和蚕豆萎蔫病毒类群。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

雏鸡感染鸡传染性贫血病病毒分布情况研究

将鸡传染性贫血病毒强毒株C364和弱毒株C545分别接种1日龄鸡传染性贫血病毒抗体阴性的健康雏鸡,于接种后第7天和14天每组抽查3只测定血球压积值,并在接种后第1、3、5、7、10和14天各组分别宰杀3只雏鸡,取胸腺、肝脏和骨髓组织,用竞争性PCR测定其病毒含量.结果表明,雏鸡感染CAV,后表现为血球压积值下降,其中强毒感染鸡较弱毒感染鸡的红细胞压积值下降幅度大;病毒能够在雏鸡胸腺、肝脏和骨髓内繁殖,其中胸腺内病毒增殖最快,病毒滴度最高,肝脏其次,骨髓最低.     

美禽流感疫苗在动物实验中显效

美国研究人员近日宣布，他们针对H5N1型高致病性禽流感病毒研制的疫苗，在动物实验中已显示了效力．这种疫苗不仅能预防H5N1型禽流感病毒，也能预防人类流感病毒和其他类型的禽流感病毒．     

多重PCR快速诊断猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型与猪细小病毒方法的建立

利用PrimerPremier5．0及DNAstar软件对猪伪狂犬病毒gB基因、猪圆环病毒2型ORF2基因和猪细小病毒VP2基因的保守区进行引物设计,选出扩增序列为猪伪狂犬病毒（373bp）、猪圆环病毒2型（430bp）和猪细小病毒（495bp）的3对引物．敏感性和特异性试验结果表明,mPCR对3种病毒的核酸检测限量从猪伪狂犬病毒至猪细小病毒分别为1．62×10-6、1．47×10-6和1．28×10-4 ng,对灭菌双蒸水、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒eDNA和猪瘟病毒eDNA的mPCR扩增结果均为阴性．mPCR可作为临床上猪伪狂犬病、猪圆环病毒2型感染和猪细小病毒病的病原学快速诊断方法．