转几丁质酶基因烟草酶活性及抗病性研究

采用荧光定量法对转几丁质酶基因烟草T2植株的几丁质酶活性进行了测定，结果表明，转基因烟草株系的几丁质酶活性明显高于未转基因烟草，同时发现，pH对转基因烟草中的几丁质酶活性有一定的影响。对转基因烟草接种烟草炭疽病菌进行抗病性鉴定。     

几丁质酶基因chiB 的克隆及表达分析

几丁质酶能够通过破坏昆虫组织中的几丁质起到抗虫作用。为获得高表达的植物几丁质酶基因载体,通过同源克隆的手段,从粘质沙雷氏菌中分离到了chiB基因,长度为992 bp,构建了pET28表达载体,并用IPTG诱导了该基因的表达。经分析发现该基因表达产物属于糖基水解酶（glycosyl hydrolases）18家族,并利用pCAMBIA2300构建了植物表达质粒pCAM-35S-chiB。     

甘薯几丁质酶基因IbChiA启动子的克隆及功能分析

几丁质酶能够水解真菌细胞壁,抑制真菌的生长与繁殖,水解产物还能诱导植物的系统抗性,在植物抗病过程中发挥重要的调控作用。本实验室前期从甘薯中克隆了几丁质酶基因IbChiA并对其进行了功能验证和表达分析,结果表明黑斑病菌强烈诱导IbChiA基因的表达,且在不同抗性甘薯品种中的表达差异显著。在此基础上,本研究在抗感品种中分别克隆了IbChiA基因的2 034 bp的启动子序列,对比后发现其序列并无差异。PlantCARE在线分析显示,IbChiA启动子中包含核心元件TATA-box和CAAT-box,还有响应真菌诱导的作用元件(W-box)以及植物激素等相关的顺式作用元件。将IbChiA基因的全长启动子及7个启动子5’端缺失片段分别替换植物表达载体pHB的2xCaMV 35S启动子,并在本生烟草叶片中进行瞬时表达。eGFP的荧光及定量表达分析显示在基因上游600 bp及以上都能够正常稳定地发挥启动子的功能,其中在-1 605～1 188 bp的片段内可能存在增强转录的顺式作用元件。本研究为进一步探索甘薯IbChiA基因的调控和表达机制提供了理论依据,并为甘薯抗病基因工程提供了一个理想的候选启...     

紫花苜蓿几丁质酶基因MsChiⅣ克隆及序列分析

本研究根据截形苜蓿(Medicago truncatula)根部的几丁质酶基因保守序列(GenBank登录号:AF167328)设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法得到了紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)根部几丁质酶基因保守序列.根据得到的保守序列设计3'端和5'端特异引物,分别从3'端和5'端扩增延长该片段,最后通过序列拼接获得紫花苜蓿根部一种几丁质酶基因的全长cDNA序列,命名为MsChiⅣ(GenBank登录号:FJ487629).MsChiⅣ基因全长为1 025 bp,开放性阅读框全长为849 bp,编码282个氨基酸,分子量为30.5 kD,预测等电点为4.66,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区,为Ⅳ类几丁质酶,属于几丁质酶第19家族,在氨基酸水平上与截形苜蓿几丁质酶蛋白同源性最高,达到98%.蛋白结构分析表明该基因编码蛋白为非跨膜蛋白,存在于细胞质中.     

一个杨树第V类几丁质酶基因的克隆及表达分析

几丁质酶是一种重要的糖苷酶,在植物抗生物及非生物胁迫的过程中发挥了重要的作用。根据序列差异及所含结构域的不同,杨树中的几丁质酶可以分为5类。其中关于第Ⅴ类几丁质酶的研究最少。本研究在加拿大杨中克隆到了一个第Ⅴ类几丁质酶基因PcCHI3。序列分析的结果显示,该基因cDNA全长1303bp,含完整的开放阅读框,可编码366个氨基酸。预测蛋白质分子质量为39.53kD。理论等电点(pI)为5.49。PcCHI3与苦瓜、烟草、梨的第Ⅴ类几丁质酶在系统进化树上同属一个分支。对PcCHI3在逆境胁迫及病原真菌诱导下的表达模式进行分析后发现,该基因可以被杨树病原真菌杨生褐盘二孢菌强烈诱导(可达对照的83倍),在干旱胁迫及盐胁迫的条件下表达量也出现了较大的上调(为对照的4~5倍)。研究结果为杨树几丁质酶功能的系统进化及林木抗性育种研究建立了一定基础。     

两个棉花几丁质酶基因的克隆与表达分析

 从棉花黄萎病缩减杂交库中得到了分属Ⅲ型和Ⅳ型几丁质酶的两个片段,它们都具有完整的3’末端。通过RACE与RT-PCR结合获得了这2个基因完整的读码框序列。其中Ⅳ型几丁质酶的开放读码框为678 bp,编码长为226个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi4;Ⅲ型几丁质酶的全长为1390 bp,编码长为298个氨基酸的蛋白,命名为Ghachi3。它们与拟南芥同源基因的相似性分别达到65%和71%。利用网上分析软件发现这2个基因都有信号肽序列,并预测编码的蛋白位于胞质体外。半定量RT PCR发现Ghachi3在花、蕾和韧皮部中的表达量较高,而Ghachi4在韧皮部表达量最高。Ghachi4仅在抗病品种受黄萎病和枯萎病的诱导后表达上调,而Ghachi3还在感病品种中受黄萎病的诱导表达。同时,在常抗棉中2个基因的表达都受到ABA的强烈诱导。推测这2个基因可能参与生物胁迫或非生物胁迫的防御反应。     

棉花核酸外切酶基因GhWRN的克隆及功能验证

【目的】本研究旨在探索棉花GhWRN基因在生长发育中的功能。【方法】用生物信息学方法分析GhWRN基因的结构特征、进化关系及上游1 500 bp的启动子片段并对其功能进行初步分析,利用实时荧光定量-聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术分析该基因在不同熟性棉花品种、不同组织及不同激素处理下的表达特性。构建过表达载体转化拟南芥,观察转基因拟南芥的表型。利用qRT-PCR分析拟南芥开花信号途径中标记基因的表达变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到GhWRN基因,生物信息学分析表明该基因编码产物含有1个保守的WRN-exo结构域,无内含子,不具有跨膜结构,为非分泌蛋白。qRT-PCR表明该基因在早熟棉花品种的二叶期开始上调表达,在植株各组织中均有表达,在雄蕊和苞片表达量较高;外源激素ABA、IAA处理后0.5 h该基因极显著上调表达。与野生型相比转基因拟南芥开花时间提前,莲座叶数量减少,qRT-PCR分析表明花发育相关关键基因AtSOC1、AtFT和AtFUL上调表达。【结论】GhWRN基因与促进植物开花相关,为进一步探究棉花的开花机制提供新线索。     

花生AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶,对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研究AhDGAT2a的表达调控,利用GenomeWalking方法从鲁花14基因组中克隆了AhDGAT2a上游5¢侧翼调控区1200 bp序列,即AhDGAT2a启动子(pAhDGAT2a)序列,并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件,发现其含有多个TATA-box和CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用pAhDGAT2a构建pAhDGAT2a:GUS植物表达载体并转化烟草品种SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的GUS表达模式,发现在转基因烟草的各个器官均有GUS酶活,而在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高,说明pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。     

紫花苜蓿Ⅲ型几丁质酶基因同源克隆与序列变异分析

型几丁质酶(chitinaseⅢ, ChiⅢ)是植物重要的防卫蛋白之一,可阻止病原菌的侵入和发展,抑制特定病害的发生,在植物抵抗病原菌的过程中具有重要作用。为了分离苜蓿ChiⅢ基因的基因组序列,进而分析其序列变异情况,本研究采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种的集群DNA中分离了9个属于a类的ChiⅢ基因(ChiⅢa)的部分基因组编码序列,分别与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的9个ChiⅢa基因相对应,将其命名为chit3-1-1、chit3-1-2、chit3-1-4、chit3-1-5、chit3-1-6、chit3-1-9、chit3-1-10、chit3-1-11和chit3-1-12。序列变异分析显示:chit3-1-1、chit3-1-2、chit3-1-5、chit3-1-9、chit3-1-10、chit3-1-11和chit3-1-12这7个基因的单核苷酸多态性(SNP)位点间的平均距离分别为28 bp、27 bp、648 bp、55 bp、64 bp、130 bp和131 bp,差异较大。表明chit3-1-5序列高度保守,chit3-1-11和chit3-1-12比较保守,chit3-1-9和chit3-1-10变异中等,而chit3-1-1和chit3-1-2的变异较大。从总体看,在苜蓿基因组中ChiⅢa基因的序列较为保守。本试验为进一步对ChiⅢ基因进行关联分析等遗传学研究和cDNA全长克隆等分子生物学研究提供了良好的基础。     

菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达

本文根据GenBank中公布的菜豆几丁质酶基因cDNA序列设计引物,通过RT-PCR得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Bchi.该基因编码一个327个氨基酸的多肽,其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽,属于Class Ia类内切几丁质酶.构建该基因的植物表达载体pMHL7133-Bchi,并通过发根农杆菌R1000介导转化烟草,经PCR和Southern blot鉴定获得了4株转基因烟草株系.几丁质酶活性分析表明,转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照.抗真菌实验结果显示,转基因烟草的叶片基本无病斑产生,表明Bchi基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性.     

球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

通过对粉虱、小菜蛾高效的球孢白僵菌HFW-05几丁质酶基因的克隆及序列分析,旨在从分子水平上了解HFW-05菌株的几丁质酶特性。根据已发表的几丁质酶基因序列(EU828354)设计几丁质酶基因全长引物,扩增HF-WBbchit1全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD19-T连接获得含有HFWBbchit1全长基因的重组质粒pMDchit1并测序。该基因的编码区包括1 047 bp,编码了348个氨基酸,分子量约为36.795 kDa,进行同源性比较分析结果表明:其基因序列与球孢白僵菌菌株NCIM1216几丁质酶基因(EU828354)和球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶基因(AY145440)的核苷酸同源性最高,同源性达到98%。氨基酸序列与球孢白僵菌菌株Bb0062几丁质酶(AAN41259)同源性达到99%。     

菜豆几丁质酶基因转化马铃薯及后代表达

通过农杆菌侵染和原生质体直接转化法把菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯加工品种大西洋中,获得了13株转化后代,经过PCR分析和Southern blot分析,在5株后代中扩增出900bp目标带,说明菜豆几丁质酶基因已整合到马铃薯四倍体基因组中。RT-PCR分析结果表明,其中的3株叶片中有菜豆几丁质酶基因的表达,而且抗病试验进一步证明了该基因在叶片中有较强的表达强度,转基因植株的抗病性比对照提高了30%以上。     

伽师瓜和86-1甜瓜几丁质酶基因的克隆与序列分析

以新疆主产不同耐藏性的甜瓜品种伽师瓜(耐藏性好)和86-1甜瓜(新密11号,耐藏性差)为试料,利用甜瓜基因组辅助设计引物克隆几丁质酶基因的c DNA序列,分别对其编码序列(CDS)及编码氨基酸进行相关生物信息学的预测分析,以期通过研究二者之间基因的差异揭示伽师瓜和86-1甜瓜采后不同耐藏性的机制。结果表明,获得的伽师瓜几丁质酶基因(Jia Shi Melon chitinase,JSMC2),NCBI检索号为KT921406;86-1甜瓜几丁质酶基因(Xin Mi-11 melon chitinase,XMMC),NCBI检索号为KU236388。JSMC2和XMMC序列长度均为1 011 bp,包含完整的开放阅读框,编码336个氨基酸,与黄瓜几丁质酶基因具有高度的同源性。蛋白结构域预测分析表明,甜瓜几丁质酶蛋白包含GH18_hevamine_Xip I_class_Ⅲ、Chi1、GH18_chitinase-like super family、Glyco-hydro-18和Glyco_18保守结构域,可催化几丁质水解成N-乙酰葡糖胺,分解真菌细胞的细胞壁,抵御病原真菌的侵染。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

转几丁质酶和核糖体失活蛋白双价基因大豆的获得与抗病性鉴定

以东北地区4个主栽大豆品种为试材,通过农杆菌介导法,将2个抗真菌病基因,即几丁质酶基因和核糖体失活蛋白基因构建在同一植物表达载体上,对受体材料进行遗传转化,获得了经Southern检测同时整合双价基因的T₀代转基因大豆植株,转化频率为0.5%。将T₀代转基因大豆植株扩繁至T₂代,并进行了大豆疫霉根腐病和大豆灰斑病的抗性检测,4个株系的抗性均比对照有明显提高。分子生物学验证及RT-PCR检测表明2个外源基因在4个株系中均进行了转录表达。     

花生AhLRPK1基因的克隆及生物信息学分析

植物受体蛋白激酶参与植物的生长发育,抗逆抗病防御反应、细胞分化、在宿主与病原菌互作过程中起着重要的作用。目前在花生上蛋白激酶基因研究较少。本研究基于前期多态性SNP标记的开发和QTL定位,获得了一个抗青枯病候选蛋白激酶基因;通过RT-PCR克隆技术获得了一段长为2 154 bp的ORF序列,暂命名为AhLRPK1;采用生物信息学方法预测并分析AhLRPK1基因编码的蛋白质常规理化性质,跨膜结构域、进化分析和高级结构等。结果表明AhLRPK1基因编码717个氨基酸为稳定的亲水性蛋白,含有一个信号肽、跨膜结构域、多个LRR基序以及一个激酶结构域;与拟南芥LRR亚家族进化同源性分析显示AhLRPK1属于LRRⅤ亚家族,与拟南芥的AT3G13065蛋白亲缘关系最近;AhLRPK1基因在花生基因芯片中表达模式分析表明,在茎和花中的表达量最大,在青枯菌诱导情况下,AhLRPK1基因在抗感花生品种中都表现出下调表达的趋势,AhLRPK1基因受乙烯利表达下调。这些结果有助于进一步验证其生物功能。     

花生Rab2基因的克隆及表达分析

Rab2是小GTP结合蛋白家族成员之一,控制着蛋白从内质网到高尔基体的运输,研究发现有些Rab2基因受多种逆境胁迫的诱导表达。为了获得花生Rab2基因,本试验根据拼接的cDNA序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR克隆了1个花生Rab2基因。测序结果显示其cDNA含有长636 bp的完整开放阅读框,编码的蛋白含211个氨基酸,推测分子量为23.4 kDa。比对分析发现花生Rab2蛋白与多种生物的Rab2的氨基酸序列具有较高的同源性,荧光定量PCR研究表明AhRab2基因受低温、干旱、盐和植物激素ABA的诱导表达。这为利用基因工程手段调控花生的抗逆性奠定了基础。     

花生蔗糖合成酶基因的克隆及序列分析

蔗糖合成酶(Sucrose Synthase,SuSy)是蔗糖代谢途径中的关键酶,在植物生长、发育和渗透调节过程中起着重要作用。为揭示蔗糖合成酶基因在花生中的抗逆机理,以花生基因组DNA为模板,利用染色体步移技术(GenomeWalking)中的TAIL-PCR技术扩增花生SuSy基因组序列和启动子区域,得到基因组序列6 189 bp,启动子预测分析表明,该序列包含约800 bp的启动子上游调控序列,13个外显子,12个内含子。启动子元件分析显示,该片段含有典型的TATA-box、CAAT-box,并存在低温响应元件LTR、GA响应元件、干旱响应MYB结合位点、厌氧诱导必要的顺式作用元件ARE等调控元件,及G-box、box4等光响应元件,说明花生SuSy基因的表达可能受低温、干旱、缺氧、光照等环境因素以及激素GA的调控。     

花生AhSOS2基因的克隆及功能初探

SOS2 (Salt Overly Sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因, 在调控细胞内离子平衡及参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。本研究通过RACE的方法, 从花生叶片中分离到一长1462 bp、包含1341 bp开放阅读框(ORF)的cDNA片段, 生物信息学分析显示, 该基因属SOS2类基因, 被命名为AhSOS2(GenBank登录号为HG797656), 编码446个氨基酸, 为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。对基因表达特性的荧光定量PCR分析显示, AhSOS2在花生中为组成型表达; 且受盐胁迫及干旱诱导。经250 mmol L^-1 NaCl处理后, 该基因在花生幼苗茎中被诱导表达, 表达量约是对照茎中的30倍; 而在30% PEG-6000模拟干旱处理下, 该基因在花生幼苗叶中表达量也明显升高。综合以上结果, 显示AhSOS2可能参与并调控花生对逆境的抗性及耐受性。目前, 已成功构建了AhSOS2的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2并获得转基因植株, 初步功能分析显示, 过表达AhSOS2基因的转基因水稻对盐胁迫的耐受性提高。预期这方面的工作对于解析花生对盐害、干旱等逆境的适应及防御机制, 进而指导花生抗性育种及品质改良具有重要意义。     

花椒几丁质酶基因ZaCHIT1的原核表达及纯化

花椒中含有的几丁质酶基因ZaCHIT1在植物病程中诱导相关蛋白表达,在植物对抗真菌病害过程中起重要作用.本研究将原核表达载体pMCSG19-ZaCHIT1转化到大肠杆菌BL 21(DE 3)菌株中,之后进行IPTG诱导表达并从诱导温度、时长和IPTG浓度3个方面检测对ZaCHIT 1重组蛋白表达的影响,以获得最优体系,...