狼山鸡-AA肉鸡嵌合体的制作及其转基因鸡研究

试验Ⅰ:以狼山鸡为供体,AA肉鸡为受体,通过赤道开窗法制作了狼山鸡-AA肉鸡的嵌合体.共操作了108枚鸡蛋,孵化成活19只,孵化成活率17.6%.获得表型嵌合体鸡胚22枚,其中15只孵化成活,嵌合体率为13.9%.对2只嵌合体公鸡解剖发现,有1只的睾丸发育异常.PCR扩增禽类W染色体特异性的重复序列发现,2只嵌合体公鸡的性腺都嵌合了供体异性的细胞.结果表明所采用的嵌合体制作方法制备转基因鸡是可行的.试验Ⅱ:利用脂质体介导法,在体外将外源pEGFP质粒转入到鸡X期胚胎细胞中,培养8 h开始有外源基因的表达,体外培养12 h后获得了21.43%的转染效率.将转染后的鸡胚盘细胞移入到受体AA肉鸡的胚下腔,孵化6 d后在8个鸡胚中检测到有外源基因的存在,阳性率为40%(8/20).     

逆转录病毒转染胚盘细胞制备嵌合体鸡胚的研究

 【目的】通过重组逆转录病毒体内感染源于第X期胚盘细胞的方法获得嵌合体鸡。【方法】将扩增的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的开放阅读框插入逆转录病毒表达载体pour-pBabe中获得重组逆转录表达载体;采用磷酸钙转染法将其与包装载体pVSVG共转入293 10A1包装细胞中进行病毒包装,得到病毒原液经超速离心浓缩200倍后注入种蛋(第X期)胚盘下腔,孵化种蛋。提取孵化5.5天的鸡胚基因组DNA,进行PCR检测和Southern杂交检测。【结果】构建含EGFP完整开放阅读框的逆转录病毒表达载体pour-pBabe-EGFP,提取孵化5.5 d鸡胚基因组DNA,经PCR、Southern杂交检测,嵌合体阳性率分别为75%和66.7%。【结论】通过用重组逆转录病毒体内感染鸡胚盘细胞的方法可获得嵌合体鸡。     

通过转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡

通过转移早期囊胚期细胞制备嵌合体鸡杜立新李善刚（山东农业大学动物科技学院关键词：嵌合体;鸡;转基因中图法分类号：Ｓ８３１．２ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮＯＦＣＨＩＭＥＲＡＳＩＮＴＨＥＣＨＩＣＫＥＮＢＹＴＲＡＮＳＦＥＲＯＦＥＡＲＬＹＢＬＡＳＴＯＤＥＲＭＡＬＣ...     

毛白杨嵌合体的研究：Ⅰ.嵌合体的认证及生物学研究

对自河北省宁晋县获得的一个特殊毛白杨无性系的初步研究表明其为一嵌合体。该嵌合体苗木的主要性状与毛白杨相似，但叶片略小，叶尖较尖以为灰绿色，表皮可纵向分为两部分，一部分平滑，另一部分有纵棱；皮孔分布均匀，菱形。     

狼山鸡(南通种群)适龄育肥的效果观测

以31～100日龄南通种群狼山鸡为素材,在能量水平相对固定的情况下,比较粗蛋白含量分别为18%、16.5%、15%饲料的育肥效果.结果表明,3种饲料育肥效果差异不显著.     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌合体的制备研究

探索了 12～ 17期鸡胚血液中的原始生殖细胞 (PGCs)迁移数量变化规律 ,将其在液氮中冷冻保存。并以Fi coll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜 3种方法对PGCs进行分离 ,结果发现 ,12～ 17期血液中均有PGCs存在 ,13期达到高峰 (4 7 1± 10 5 )个·μL-1,在血液中比例为 0 0 12 6 %。冷冻保存 3个月后解冻成活率达 80 %以上。3种分离方法所得的分离效果分别为 95 7%、39 2 %、6 3 0 % ;纯度为 2 7 5 %、8 4%、3 1%。将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至 14～ 15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌合体 ,获得 8只雏鸭 (8/ 110 )。以鸡W特异性DNA探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞 ,嵌合率达 84 2 % (16 / 19)。表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中 ,并有可能增殖分化成有功能的配子     

狼山鸡消化道乳酸菌的分离·鉴定以及生物学特性研究

[目的]分离和鉴定狼山鸡消化道乳酸菌,为开发新型禽用微生态制剂提供依据。[方法]利用厌氧菌分离技术,从狼山鸡肠道中分离乳酸菌,通过形态、生理生化特性、16S rRNA基因序列测定以及同源性分析对其进行鉴定,并对菌株进行耐酸性、抗菌活性等筛选。[结果]分离到5株乳酸菌LCr-01、LCr-02、LCe-01、LCe-02、LCe-03,经过生理生化试验、16S rRNA基因序列测定以及同源性分析,初步鉴定植物乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌以及嗜酸乳杆菌。其中,LCr-02具有较强的耐酸性和抗菌活性。[结论]筛选到的5株菌乳杆菌中LCr-02具有较强的耐酸性与抗菌活性。     

转基因动物研究综述

综述了转基因动物的制作方法、转基因家畜类、转基因鱼类、转基因禽类研究成就。     

观赏植物花色嵌合体及其育种学应用

花色嵌合体是一种特殊的植物材料,在观赏园艺应用中具有极高的经济价值与研究意义。在比较说明几种花色嵌合体形态特征的基础上,讨论了植物花色嵌合体的形成原因及细胞学机制,并且探讨了花色嵌合体在观赏植物育种中的应用。     

利用精原干细胞建立转基因动物的研究进展

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物体内的一种成体干细胞,在睾丸微环境中既具有自我更新潜能,又具有定向分化潜能,是自然状态下出生后,动物体内在整个生命期间进行自我更新并能将基因传递至子代的唯一成体干细胞。精原干细胞在建立转基因动物中具有重要的应用价值,现已成为转基因研究领域的热点之一。介绍了精原干细胞的来源、形成、类型及分化,同时对其在转基因动物研究中的应用做一综述。     

转化pCAMBIA1301载体蓝猪耳F_1代植株的花粉育性研究

通过自花和异花授粉、电镜扫描、花粉活力测定等方法,对转pCAMBIA1301基因蓝猪耳的9个转基因株系的F1代植株的育性进行了研究.结果表明:蓝猪耳不存在自交不亲和现象但其转基因植株出现花粉败育;对9个转基因株系进行测定,发现其花粉活力与对照(77.3%)差异显著,仅为9.8%~30.6%,表明转基因蓝猪耳花粉败育不是由于基因的插入引起的,普通培养基组培瓶蓝猪耳花药活力与在土壤中萌发的蓝猪耳花粉活力均为75%左右,表明组培环境也不是引起花粉败育的原因,因此继代培养基是引起花粉不育的唯一原因.     

多抗转基因水稻植株的获得及其抗性鉴定

利用转Xa21基因(抗白叶枯病)纯合稳定的圣稻301与转Bt基因(抗螟虫)、转car基因(抗除草剂)的纯合稳定株系GK-1杂交,依据田间抗病虫性表现,利用标记基因选择,分子标记辅助选择,获得了多抗转基因水稻植株,其中某些多抗转基因水稻株系表现出良好的农艺性状和丰产潜力。     

巨核酸酶I-SceI转基因元件的构建及其在斑马鱼中转基因效率的评估

巨核酸酶I-SceI是由酿酒酵母线粒体中的核糖体大亚基上的I型内含子编码的一种核酸内切酶,近年已被应用于转基因研究中。I-SceI介导的转基因大多是将I-SceI蛋白和带有其识别位点的质粒共注射于动物的受精卵,但注射酶蛋白前期处理耗时长且工作量大,直接用I-SceI的mRNA代替蛋白进行注射可更为简捷。本研究应用I-SceI mRNA介导荧光蛋白基因在斑马鱼中的转植,进一步了解其转基因效率。首先设计合成带有巨核酸酶I-SceI编码序列的辅助质粒,pCS2-I-SceI,并分别构建了带有巨核酸酶I-SceI识别位点、EF1α启动子和荧光蛋白基因（eGFP/RFP）编码序列的供体质粒pI-SceI-EF1α-eGFP/RFP。辅助质粒pCS2-I-SceI体外转录成mRNA, 以50ng/μl供体质粒和100ng/μl的I-SceI巨核酸酶mRNA共注射到斑马鱼（Danio ririo）受精卵中,注射后48 h时的斑马鱼eGFP的平均荧光表达率可达75.86%。在斑马鱼的头部、躯干到尾部均可观察到荧光蛋白的表达,且随着胚胎发育,荧光信号逐渐增强。结果表明I-SceI系统在斑马鱼中可介导较高效率的转植,具有在经济鱼类转基因研究中应用的潜力。     

转基因水稻环境安全研究进展

随着抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆境和高产优质的转基因水稻从实验室逐渐走向开放环境,转基因水稻可能带来的环境安全问题已引起了广泛的关注。本文就近年来我国转基因水稻环境安全方面的研究工作进行了综述,主要包括转基因漂移及其生态风险,转基因对非靶标生物和生物多样性的影响,转基因对土壤生物群落的影响及转基因水稻本身杂草化风险等方面,旨在为转基因水稻的生物安全研究和转基因水稻商品化提供科学参考。     

转基因玉米的脉冲电泳技术检测及遗传分析

采用脉冲电泳技术将外源Bar基因和 B.t基因转化玉米种胚并直接成苗,对T0代、T1代经除草剂筛选的抗性植株进行PCR检测.结果表明,T1代转基因植株频率明显低于T0代PCR阳性植株率,T0代植株的PCR阳性率与T1代转基因植株频率呈显著正相关(r =0.9874).T1代表现为PCR阳性的植株Southern杂交结果显示脉冲电泳法介导的外源基因在受体中多为单拷贝,且能从T1代遗传到T2代,外源基因在T2代呈典型的孟德尔分离方式.     

转manA基因小鼠F1代表达效果的检测分析

将携带茁-甘露聚糖酶基因manA 的转基因FVB 原代小鼠与“生型FVB 小鼠进行繁殖得到F1代,通过 PCR 和Southern blot 鉴定出F1代转基因小鼠。提取转基因小鼠腮腺、舌下腺、下颌下腺、心脏、肝脏等组织的总RNA, 通过RT-PCR 检测出manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺组织特异性表达。进行定量PCR 验证出manA 基因在302 号家系小鼠的舌下腺中表达量最高,证明茁-甘露聚糖酶基因manA 在转基因小鼠的腮腺和舌下腺特异性表达成功。 对转基因小鼠唾液进行收集测定茁-甘露聚糖酶活性,在302 号家系中检测到酶活性较高。通过代谢试验测定饲料 中粗蛋白、粗纤维和粗脂肪的消化率,结果显示,与非转基因小鼠相比,302 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗纤 维的表观消化率无明显差异,而粗脂肪的消化率得到显著提高;304 号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗 纤维消化率方面均无明显差异。     

脑部特异表达SV40Tag转基因动物模型的建立

将猿猴病毒抗原蛋白(SV40Tag)片段克隆进脑部特异表达载体pMM279中,通过显微注射法制作转基因小鼠。采用PCR和Southern blotting检测目的基因整合,并通过RT-PCR检测目的基因的表达。结果表明:共出生29只仔鼠,经PCR检测出3只阳性,Southern blotting检测出2只阳性。RT-PCR检测到SV40Tag仅在前脑部皮层和海马表达。成功获得的脑部特异表达SV40Tag转基因小鼠模型,为SV40Tag的致病机制及脑肿瘤的治疗等研究提供工具。     

OsVIP1 RNAi转基因水稻植株的构建

为进一步阐明农杆菌介导的遗传转化分子机制,进而利用分子生物学方法提高农杆菌转化水稻效率,以水稻品种中花11为遗传转化受体材料,利用RNAi技术对水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白进行了功能研究。通过同源性比对得到水稻中拟南芥AtVIP1蛋白的同源蛋白序列,命名为OsVIP1,构建了该蛋白基因2个片段(R1和R2)的RNAi表达载体pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2,通过农杆菌介导的方法分别转化水稻中花11。对转基因抗性愈伤进行统计,结果表明,由携带pDS1301-2-R1和pDS1301-2-R2载体转化的抗性愈伤的形成受到一定程度抑制。经PCR检测,证明2个片段R1和R2均成功整合到再生水稻植株基因组中;半定量RT-PCR分析显示部分RNAi转基因植株中OsVIP1基因表达被成功抑制。