小鼠腔前卵泡卵母细胞的采集和体外成熟

酶消化配合机械分离，采集１０日龄小鼠腔前卵泡中的卵母细胞－颗粒细胞复合体（ＯＧＣｓ），以自制的胶原膜为底物，在ＭＥＭ培养液中培养１０ｄ，卵母细胞－颗粒细胞复合体由１１０．５±１８．６μｍ增长到１８４．４±６０．６μｍ，卵母细胞由５６．２５±２．０μｍ增长到８２．０±１０．５μｍ．３６．７％的ＯＧＣｓ具有５层以上颗粒细胞，其中９．１％放出第一极体。     

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外受精试验

抽吸法采集２￣６ｍｍ山羊卵巢大腔卵泡卵母细胞后，以１．５ｍｍ间距纵横切割卵巢，回收（２ｍｍ小腔卵泡卵母细胞。随机测量其直径为１２９．８６±１８．８４μｍ。将２１８枚卵丘细胞层致密完整的卵母细胞分别培养于含颗粒细胞并用２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ缓冲的①ＴＣＭ１９９＋１％ＧＳ，②①＋ＦＳＨ，ＬＨ（１０μｇ／ｍＬ）＋１７β－Ｅ２（１μｇ／ｍＬ），③②＋ＩＴＳ（５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的采集和体外成熟

酶消化配合机械分离，采集１０日龄小鼠腔前卵泡中的卵母细胞一颗粒细胞复合作（ＯＧＣｓ），以自制的胶原膜为底物，在 ＭＥＭ培养液中培养 １０ ｄ．卵母细胞－颗粒细胞复合体由 １１０． ５±１８． ６ μｍ增长到 １８４．４±６０． ６ μｍ，卵母细胞由 ５６． ２５±２． ０ μｍ增长到 ８２． ０±１０． ５μｍ．３６．７％的ＯＧＣ．具有５层以上颗粒细胞，其中９．１％放出第一极体。     

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

采集繁殖和非繁殖季节山羊卵巢，回收大腔（３～６ｍｍ）和小腔（＜２ｍｍ）卵泡卵母细胞，进行体外成熟和受精，结果如下：①繁殖季节的大腔和小腔卵泡卵母细胞体外成熟率（６８．４％，２７．５％）均显著（Ｐ＜０．０５）高于非繁殖季节（５２．５％，２０．６％）；②１和１．５周岁龄羊与成年羊相比，前两者的小腔卵泡卵母细胞采集数显著（Ｐ＜０．０５）多于后者（２５．６，２２．５：１５．ｌ），但卵母细胞体外成熟率无显著差异（Ｐ＜０．０５）；③随卵母细胞直径增加，其体外成熟率呈显著上升趋势；④与加新生犊牛血清和生殖激素在颗粒细胞悬浮液中培养相比，加发情山羊血清和激素在颗粒细胞单层上培养可显著（Ｐ＜０．０５）提高小腔卵泡卵母细胞体外成熟率（２０．８％：３４．５％）；⑤将体外成熟的小腔卵泡卵母细胞与体外获能精子进行受精，其受精率为３５．７％（５１／１４３）。     

特定电磁波照射对家兔体外受精的影响

家兔精液用特定电磁波（ＴＤＰ）照射３ｍｉｎ，精子体外获能采用ｍ—ＨＩＳ（１５ｍｉｎ）＋ｍ－ＤＭ（２－４ｈ）．家兔卵母细胞经ＴＤＰ照射５ｍｉｎ并体外培养１０－１２ｈ．家兔的卵泡卵母细胞经体外受精和体外培养的结果表明，经ＴＤＰ照射的精液与未经ＴＤＰ照射的卵母细胞的体外受精，原核形成率达６４．７％，对照织为４４．４％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５６．８％和５０％（Ｐ＞０．０５），经ＴＤＰ照射的卵母细胞与未经ＴＤＰ照射的精液的体外受精，原核形成率达６３．７％，对照组为４６．７％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５８．９％和４７．２％（Ｐ＞０．０５）、用ＴＤＰ照射精液或卵母细胞能显著提高其体外受精率．     

重组牛生长激素对山羊卵泡卵母细胞体外成熟的影响

将３０７枚Ａ、Ｂ级卵丘－卵母细胞复合体（ＣＯＣ）分别培养于：改良ＴＣＭ１９９＋ＦＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）＋ＬＨ（２０μｇ／ｍｌ）＋２０％ＮＣＳ（Ａ液）、Ａ液＋重组牛生长激素（ｒｂＧＨ）１５ｎｇ／ｍｌ、改良ＴＣＭ１９９＋ｈＣＧ（２０μｇ／ｍｌ）＋ｒｂＧＨ＋２０％ＮＣＳ三种培养基中，获得５３１％、６７９％和６３５％的成熟率。结果表明，ｒｂＧＨ对山羊卵泡卵母细胞的体外成熟是有益的。     

特定电磁波照射对家兔体外受精的影响

家兔精液用特定电磁波（ＴＤＰ）照射３ｍｉｎ，精子体外获能采用ｍ－ＨＩＳ（１５ｍｉｎ）＋ｍ＿ＤＭ（２－４ｈ），家兔卵母细胞经ＴＤＰ照射５ｍｉｎ并体外培养１０－１２ｈ，家兔的卵母细胞经体外受精和体外培养的结果表明，经ＴＤＰ照射的精液与未经ＴＤＰ照射的卵母细胞的体外受精，原核形成率达６３．７％，对照组为４４．４％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５６．８％和５０％（Ｐ＜０．     

杜冷丁两种不同给药方法对急性心梗疗效的观察

将３２例ＡＭＩ病人随机分为两组，采用杜冷丁定时止痛和临时止痛的给药方法控制胸痛症状。观察到杜冷丁定时止痛组病人的胸痛缓解为２．７±０．７ｄ、ＣＰＫＩ恢复为３．４±２．１ｄ、心电图ＳＴ段回复等电位线为５．３±１．２ ｄ，心律失常发生率６１．５％、室早提前指数１．２１±０．１６；临时组病人胸痛缓解为３．５±０．６ ｄ、ＣＰＫ恢复为４．２±１．６ ｄ、心电图ＳＴ段回复等电位线为６．２± １．７ ｄ，心律失常发生率９４．８％、室早提前指数１．０５ ± ０．１２，两组有显著性差异（ Ｐ ＜０．０５）。杜冷丁定时止痛疗效较好，提示对ＡＭＩ病人的剧烈胸痛症状采取主动、积极、有效的止痛措施控制胸痛，是抢救ＡＭＩ的关键之一。     

5种常见呼吸疾病患者血浆激肽释放酶的检测及其临床意义

用发色底物法对５种呼吸系统疾病患者及健康人作了血浆激肽释放酶（ＰＫ）的检测，结果显示：（１）肺心病组（４０例）为１３３．７％±４２．０％；（２）慢阻肺组（３０例）为１３０．８％±３２．９％；（３）哮喘组（１３例）１５５．０％±４１．７％；（４）胸腔积液组（２１例）为１１９．３％±４１．４％；（５）肺癌组（１１例）为１２７．０％±４１．７％；（６）对照组（健康人１００例）为９７．２％±２６．８％（对照组ＶＳ（１）、（２）、（３）组比Ｐ＜０．０１；对照组ＶＳ（４）、（５）纽比Ｐ＜０．０５）。对其临床意义作了讨论。     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的采集、体外发育和体外成熟

采用机械法分离成年小鼠和１３日龄小鼠腔前卵泡，两组中每只小鼠平均回收率分别为４９２９±１０８１和７６８３±９１５个；腔前卵泡卵母细胞培养１０天后，两组恢复成熟分裂卵的比例分别为１９３％和２０９％。试验结果表明，小鼠腔前卵泡卵母细胞在培养后第５天开始发生ＧＶＢＤ，此后，ＧＶＢＤ和抛出ｐｂＩ的卵母细胞数量逐日增加。     

不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响

为确定不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响,探讨最佳培养体系,比较了M199培养液中3种FSH浓度(0.5、1、2IU/mL)对腔前卵泡体外培养的影响。结果表明:FSH浓度为2IU/mL时腔前卵泡的生长率最高,2 IU/mLFSH与0.5IU/mLFSH相比,在卵泡生长率、成腔率和存活率上都存在着显著差异(P<0.05)。3个处理组腔前卵泡前5d生长率与后5d相比差异极显著(P<0.01)。结论:高浓度的FSH能显著地促进腔前卵泡的生长和腔的形成,且能够提高腔前卵泡的成活率。猪腔前卵泡体外培养呈前高后低的生长模式。     

猪腔前卵泡的体外培养

为确定不同基础培养液和培养方法对猪腔前卵泡体外培养的影响,试验采用了M199和NCSU23两种基础培养液及96孔培养板法、凹窝培养法和颗粒细胞铺层培养法对猪腔前卵泡进行体外培养。结果表明:培养在M199的腔前卵泡生长显著快于培养在NCSU23的腔前卵泡,培养在该2组的猪腔前卵泡前5 d的生长速度都极显著地高于后5 d的生长速度,而腔前卵泡的成腔率和存活率没有明显差异;培养在凹窝培养体系的腔前卵泡生长速度显著低于96孔培养板法,但凹窝培养体系可以显著地增加腔前卵泡的存活率。同时证明,颗粒细胞铺层培养法对腔前卵泡生长没有显著影响。     

猪卵泡液和胎牛血清对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响

本研究探讨了猪卵泡液(pFF)和胎牛血清(FCS)对猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的影响。将猪小腔卵泡(直径<2mm)卵母细胞-卵丘复合体(COCs)以15～35枚为一组随机置于添加不同浓度(0、5%、10%、20%)pFF(试验一)或不同浓度(0、5%、10%、20%)FCS(试验二)的改良TCM-199成熟液中培养44～48h,观察卵母细胞的核成熟率和卵丘扩散情况。试验一结果显示,成熟液中添加10%pFF与对照组和添加5%、20%pFF组相比,显著提高猪小腔卵泡卵母细胞的核成熟率(28 2%比20 5%、20 9%、22 3%;p<0 05);添加5%和20%pFF组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵母细胞核成熟率之间差异不显著(p>0 05);添加5%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,添加10%和20%pFF组的COCs卵丘细胞呈现第4类扩散,而不添加pFF的对照组的COCs卵丘细胞呈现第2类扩散。试验二结果显示,成熟液中添加10%FCS与对照组和添加5%、20%FCS组相比,明显提高猪小腔卵泡卵细胞的核成熟率(60 0%比37 5%、40 2%、43 9%;p<0 05);添加5%和20%FCS组与对照组相比,它们的小腔卵泡卵细胞核成熟率之间差异不显著(p<0 05);FCS在COCs体外成熟培养的前22～24h促进了卵丘扩散(3个处理组的COCs卵丘细胞呈现第3类扩散,而对照组COCs的卵丘细胞呈现第2类扩散)。研究结果表明:(1)成熟液中添加pFF可促使猪小     

牛卵巢卵母细胞体外成熟的研究

研究了卵巢采卵方法以及卵巢保存温度和时间、性周期阶段、激素和培养基对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:从屠宰场获取的卵巢,先切剖或抽吸卵泡再切割卵巢,可显著提高可用卵母细胞数。卵巢保存时间在 2 h 以内最好,最长不超过 6 h。30~39 ℃的生理盐水保存卵巢,卵母细胞的成熟率(63.9 %)和卵裂率(34.4 %)均显著高于 2~8 ℃(16.7 %、0 %)和 20~29 ℃(54.1 %、31.7 %)保存的。采集卵母细胞时卵巢所处性周期阶段(卵泡期、黄体期)对卵母细胞体外成熟的影响不大(成熟率分别为 69.2 %、64.3 %)。M199 是牛卵母细胞体外成熟理想的培养基,M199 + 50 IU/mL LH+ 100 IU/mL FSH + 1μg/mL 17?-E2和 M199 + 50 IU/mL GnRH+1μg/mL 17?-E2都是牛卵母细胞体外成熟理想的培养系统(成熟率分别为 69.4 %、67.5 %,卵裂率分别为 35.4 %、42.7 %)。     

牛小腔前卵泡体外生长发育的研究

 在添加有ITS、丙酮酸钠、次黄嘌呤、血清、FSH、LH、E2的α-MEM基础液中加入表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维生长因子(bFGF)及氢化可的松（HC），对直径＜100 ?m（平均直径61～70?m）的牛小腔前卵泡进行体外培养。结果表明，试验I，在FSH、LH、E2浓度分别为0.25 ?g·ml-1、5 iu·ml-1、0.5 ?g·ml-1时，卵泡体外培养7 d， EGF和bFGF联合存在好于分别单独存在时的培养效果，当bFGF（25 ng或50 ng）剂量保持不变，提高EGF含量（25 ng,50 ng）有抑制卵泡发育的作用；增加bFGF的剂量有助于腔前卵泡的发育。 试验II，当FSH、LH、E2分别调整到4 ?g·ml-1、10 iu·ml-1、0.1 ?g·ml-1，并添加了氢化可的松（40 ng·ml-1），卵泡体外培养13 d，在试验3组（EGF 25ng）和试验4组（EGF 25 ng+ bFGF 50 ng），卵泡发育率和卵泡平均增长直径均显著好于试验1组（未添加EGF、bFGF、氢化可的松）和试验2组（只添加氢化可的松）。体外培养第20 d，试验3组和试验4组卵泡发育率分别为15.79 %和25.58 %，卵泡最大增长直径分别为300和320 ?m，并形成小的卵泡腔（成腔率分别为7.69 %和17.65 %），而试验1组和试验2组其卵泡发育率均为0。表明体外培养腔前卵泡时，不同的培养体系对其生长发育有十分重要的影响，各种成分之间存在互作的关系。     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

LPS对鹅等级卵泡基质层TLR家族基因表达的影响

【目的】研究鹅卵泡基质层TLR家族基因表达谱及其对LPS不同处理时间后的反应性。【方法】在大群散养条件下,实时观察鹅产蛋过程,分别在产蛋后8和2 h以及产前4、16和28 h注射LPS,并在产蛋后8h屠宰,即LPS作用0、6、12、24和36 h,每个时间点各5只鹅。屠宰时,取卵巢,观察卵泡外观形态,并分离F1-F5级卵泡基质层。试验鹅自由饮水、自由采食、自然光照。LPS处理0、24和36 h的单个F1-F5级卵泡基质层或卵泡用于基因表达分析,而其他LPS处理的每只鹅等级卵泡基质层RNA等质量混合后用于基因表达分析。采用普通PCR方法检测10种鸟类TLR家族基因的在鹅等级卵泡基质层的表达谱,其中以脾脏组织为阳性对照,以不加c DNA模板为阴性对照。根据RT-PCR的表达谱结果,采用Real-time PCR检测不同等级卵泡基质层TLRs表达水平以及不同LPS处理时间对基质层TLRs表达水平的影响。对不同等级卵泡和不同LPS处理时间对基质层TLRs表达的数据,采用单因子方差分析,Duncan法多重比较;对变性卵泡与对照组基质层TLRs表达水平的数据,采用T检验分析。【结果】(1)已公开的10种鸟类TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2A、2B、3、4、5、7、15和21基因均在等级卵泡基质层组织中表达。(2)随等级卵泡生长,TLRs 2A和15表达水平逐渐升高;F1级卵泡基质层TLR2A表达水平显著高于F3、F4和F5级卵泡,TLR15表达水平显著高于F5级卵泡;其他TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2B、3、4、5、7和21在不同等级卵泡基质层中的表达水平差异不显著。(3)在LPS处理0、6和12 h时,等级卵泡外观形态无明显变化,但在LPS处理24 h时,3只鹅的等级卵泡呈深黄色胶冻状变性;在LPS处理36 h时,全部试验鹅等级卵泡呈深黄色胶冻状变性。(4)与对照组(LPS处理0 h)相比,TLRs 2A、4和5表达水平在LPS处理12和24 h时显著升高,TLR2B表达水平在LPS处理24 h时显著升高,TLRs 7和15表达水平在LPS处理6-24 h期间均显著升高,而TLRs 1A、1B、3和21表达水平在LPS处理6-24 h期间差异不显著。(5)与等级卵泡基质层相比,在LPS处理24和36 h的变性卵泡中,TLRs 1A、2A、2B、4、5、7和15表达水平显著升高,TLR3表达水平显著降低,而在LPS处理36 h的变性卵泡中,TLRs 1B和21表达水平显著升高。【结论】已发现的10种鸟类TLR家族基因均在种鹅等级卵泡基质层表达,且随LPS作用时间延长,等级卵泡形态结构发生变化,但TLRs表达水平逐渐升高。     

MIF在不同直径猪卵泡的表达变化规律

为分析巨噬细胞迁移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)在不同直径健康猪卵泡上的表达变化规律,将收集到的90个健康母猪卵巢,通过ELISA检测不同直径卵泡液中MIF质量浓度,通过实时荧光定量PCR和Western blot检测颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白的表达水平,采用免疫荧光检测MIF在颗粒细胞中的分布情况。结果显示:1)中等直径卵泡(3～4mm)液中MIF的质量浓度(54.17±7.86ng/mL)显著高于大卵泡(6mm,32.29±1.47ng/mL)和小卵泡(1～2mm,38.89±0.98ng/mL)(P0.05);2)中等直径卵泡颗粒细胞中MIF基因mRNA和蛋白质表达量也显著高于大卵泡和小卵泡的表达量(P0.05);3)MIF也在不同直径卵泡颗粒细胞中的细胞核和细胞质表达,但多集中于细胞质中。综上,随着猪卵泡发育过程,MIF在中等直径卵泡中表达量最高。本研究为母猪卵泡发育和排卵提供新的线索。     

活体采卵时间间隔对牛克隆胚胎发育的影响

采用活体穿刺技术（ovum pick up,OPU）,分别间隔3／4（1周2次）、5、7、10、14d对同一批荷斯坦奶牛进行穿刺采卵,根据优势卵泡直径和所有卵丘细胞-卵母细胞复合体的状态确定采卵时卵泡所处的发育阶段,从而确定卵泡波的发育动态变化。并以间隔不同时间采卵获得的卵母细胞成熟后进行体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）制备克隆牛胚胎。重构胚体内培养7d后,通过比较克隆囊胚的发育率判定卵母细胞质量的差异,从而确定最佳的采卵时间间隔。结果显示：①穿刺采集所有直径超过3min的卵泡后,可起始1个新卵泡波,大约5d后从属卵泡开始进入凋亡阶段,7d后进入晚期凋亡阶段,第7～10d又起始1个新的卵泡波,第14d时第2个卵泡波中的从属卵泡起始凋亡。②间隔不同时间组克隆囊胚发育率存在差异,间隔3／4d（1周2次）为23．1％,间隔5d组为15．0％,间隔7d组为10．9％,间隔10d组为4．9％,间隔14d组为29．0％。结果显示：间隔不同的时间采卵,卵泡所处的发育状态存在差异。并对卵母细胞质量具有显著的影响。     

Effect of GPAG Supplement on Porcine Oocyte Maturation and Its Following Embryonic Development by Parthenogenetic Activated

The aim of this study was to compare the effect of GPAG and commonly used FCS on porcine oocyte maturation and subsequent embryonic development after the fertilization. COCs were aspirated from follicles and cultured for 16, 24, 32, 40 and 48 h in TCM-199 medium either with GPAG or FCS. After 24 h with GPAG, 89.4% of oocytes reached M Ⅰ stage while in the medium supplemented with FCS, only 27.7% of oocytes reached the same stage （P〈0.05）. Prolonged incubation for up to 32 h clearly demonstrated that some of oocytes cultured in GPAG medium were at M Ⅱ stage （35.7%）, few of oocytes from FCS medium were at M Ⅱ stage （7.5%） （P〈0.05）. Both groups of oocytes reached the same stage of maturation within 48 h. After 48 h of culture, the oocytes with extruded polar bodies were inseminated. Fertilized oocytes were cultured in PZM3 medium supplemented with 3 mg.mL of BSA. After 7 days, the development and the quality of embryos were evaluated. The results showed that the maturation of oocytes in the presence of GPAG significantly increased their subsequent developmental ability when compared with FCS supplementation （29.2% ： 18.9% of blastocysts, P〈0.05）. However, differential staining revealed that once blastocysts were formed in either group, they had the same total cell number （39 ： 38） and the ICM/total cell ratio （0.26 ： 0.28）