马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata是一种抗逆性极强的世界性检疫害虫,对温度胁迫具有很强的适应性,为进一步明确其对温度胁迫适应性的分子生态机制,采用RT-PCR及RACE技术克隆得到了1个hsp90基因的cDNA全长序列,命名为Ld-hsp90,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后相对表达量的变化。Ld-hsp90全长为2 489 bp,开放阅读框(ORF)长度为2 160 bp,编码719个氨基酸,理论等电点为4.98,分子量约为82.09 kD,5'端与3'端非编码区长度分别为113 bp和216 bp。氨基酸序列中含有HSP90家族的5个签名序列及胞质特征序列MEEVD。实时荧光定量PCR检测结果显示:38℃和44℃高温热激1 h,马铃薯甲虫成虫体内的Ld-hsp90的表达量均显著高于对照组,而0℃与-10℃低温处理1 h后的表达量与对照组均无显著差异。研究表明Ld-hsp90的上调表达在马铃薯甲虫抗高温中起着重要的作用。     

短时高温胁迫对褐飞虱存活及其热激蛋白基因hsp70表达的影响

为探讨短时高温胁迫对褐飞虱成虫存活的影响及热激蛋白基因hsp70在此过程中的作用,通过室内试验观察羽化24 h内的褐飞虱成虫经过不同高温(31~40℃)暴露和不同恢复时间(1~72 h)后的存活及其体内hsp70表达情况,并构建了褐飞虱hsp70实时荧光定量RT-PCR检测体系。结果表明,褐飞虱在31~39℃下暴露2 h对其成虫存活无显著影响,39.5℃下其存活率显著降低,为44.4%,40℃下无成虫存活;在37℃下暴露2 h后,在12 h的恢复时间内褐飞虱的存活率与对照组无显著差异,但随着恢复时间延长存活率迅速下降。缓和高温(31℃和33℃)对褐飞虱成虫hsp70表达具有诱导作用,其表达量分别为对照组的3.8和6.7倍;在35℃和37℃时达到最高峰,为对照组的291.2和232.5倍;当温度达到39℃和39.5℃时hsp70表达量呈下降趋势,但仍为对照组的46.7和26.2倍。褐飞虱37℃处理2 h后,随着恢复时间的延长,hsp70基因表达水平迅速下降,恢复48、72 h时,仅为对照组的0.4和0.7倍。推测该基因的表达在褐飞虱抵抗短时高温胁迫过程中具有重要作用。     

三叶草斑潜蝇hsp70的克隆及其表达量在高低温胁迫下的变化

为了明确高低温胁迫对三叶草斑潜蝇hsp70表达量的影响,采用RT-PCR和RACE技术获得了1条三叶草斑潜蝇诱导型热激蛋白基因hsp70,命名为Lthsp70-1,并利用实时荧光定量PCR技术检测其在温度胁迫后的表达量.该基因的开放阅读框为1923 bp,编码640个氨基酸.氨基酸序列中含有HSP70家族的签名序列IFDLGGGTFDVSIL和IVLVGGSTRIPK、DnaK特征基序IDLGTT(Y)S(C)V、非细胞器基序RARFEEL,以及C末端的保守序列EEVD.实时荧光定量PCR结果显示:成虫在31～33℃范围内,其hsp70表达量随温度升高而上升,33℃时达到最高峰;35～39℃时,hsp70表达量迅速下降;蛹经0℃胁迫0.5～2.0 h,其hsp70表达量随时间延长呈上升趋势.由此可见,高低温胁迫均能诱导三叶草斑潜蝇hsp70的表达.     

小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析

为明确热激蛋白70在小麦条锈菌对高温适应性中的作用,采用RACE和PCR技术扩增得到小麦条锈菌hsp70的基因全长,并利用实时荧光定量PCR技术对热胁迫下不同温度敏感类型小麦条锈菌中hsp70的表达特征进行分析。克隆得到的小麦条锈菌hsp70基因组序列全长为2 817bp,包含7个内含子,cDNA序列全长为2 267bp,其中开放阅读框为1 917bp,编码639个氨基酸,分子量为66.7ku,等电点为5.15。编码蛋白含3个保守的HSP70氨基酸序列。qRT-PCR试验结果表明,28℃热激后,hsp70的转录水平随热激时间的延长而略有增加,2h达到最高值。不同温度敏感类型菌株在热激2h后hsp70的相对表达量具有显著差异。低敏感类型菌株hsp70平均表达量为未经处理对照的7.12倍,而高敏感类型菌株hsp70平均表达量仅为对照的1.63倍。     

星豹蛛PaCYP3001U16基因的克隆与表达分析

为探究细胞色素P450基因在星豹蛛Pardosa astrigera体内的表达特性及对溴氰菊酯胁迫的响应,采用反转录PCR技术克隆其细胞色素P450基因并进行序列分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术分析其在星豹蛛各发育阶段及雌雄成蛛不同部位的表达水平,同时分析其在溴氰菊酯不同浓度胁迫下和不同处理时间后的表达模式。结果显示,在星豹蛛雌成蛛中克隆得到1个细胞色素P450基因,其开放阅读框为1 473 bp,编码490个氨基酸,命名为PaCYP3001U16(GenBank登录号为MZ643213)。PaCYP3001U16基因在星豹蛛各发育阶段均有表达,其中在成蛛期的表达量最高,在6龄幼蛛期的表达量最低;该基因在雌雄成蛛腹部的表达量显著高于在头胸部及足部的表达量。星豹蛛雄成蛛经LC10(5.151 mg/L)、LC30(8.619 mg/L)和LC50(12.311 mg/L)溴氰菊酯处理12 h,PaCYP3001U16基因的表达量均被抑制,且在LC50处理下表达量最低。PaCYP3001U16基因经LC30溴氰菊酯处理...     

温度胁迫对荒漠昆虫小胸鳖甲(鞘翅目:拟步甲科)幼虫热激蛋白基因hsp70表达的影响

热激蛋白在昆虫响应环境胁迫中发挥作用,然而在准噶尔盆地的拟步甲科特有种小胸鳖甲Microdera punctipennis幼虫对环境的适应过程中热激蛋白如何发挥作用尚不清楚。本研究利用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术测定了高低温处理后小胸鳖甲各龄幼虫热激蛋白hsp70基因的表达变化,以探讨小胸鳖甲幼虫hsp70对温度胁迫的响应方式。结果显示,在6-7龄幼虫中hsp70基因的表达水平是5龄之前幼虫的3-5倍,表明hsp70具有发育阶段性差异表达;各龄幼虫经42℃高温处理1 h后hsp70基因的表达量都迅速增加并达到高峰,其中2-5龄的响应非常强烈,可达对照的一千至数千倍;冷驯化低温5℃和10℃对不同龄期幼虫hsp70表达的影响有所不同,其中1龄和4龄幼虫对5℃和10℃均有上调响应,且1龄的响应程度远高于4龄;而7龄幼虫的hsp70表达则受5℃抑制,在10℃短时间内受到诱导,长时间则受到抑制;耐寒性测定结果显示,1龄和7龄幼虫无冷驯化现象,而4龄幼虫经过5℃或10℃冷驯化2 h可使其在-10℃的存活率提高25%,表明hsp70基因表达与小胸鳖甲耐寒性无直接相关性。本研究结果将有助于全面认识HSP70在荒漠昆虫环境适应性中的作用机制。     

高温胁迫下绿豆象内参基因筛选及其Hsp70基因的表达特性

为明确Hsp70蛋白在绿豆象Callosobruchus chinensis高温耐受性中的作用,该研究筛选并克隆β-actin、α-tubulin、β-tubulin、EF1-α、GAPDH、Hsc70、AK和RPL40八个候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术测定其在绿豆象雌雄成虫体内的表达量,通过geNorm、BestKeeperr和NormFinde软件对这8个候选内参基因的表达稳定性进行评价,选择最适宜的内参基因对不同高温胁迫下绿豆象体内Hsp70基因的表达特性进行测定。结果表明,8个候选基因引物均有良好的特异性和引物扩增效率,引物扩增效率介于91.6%～108.1%之间。高温胁迫下,β-tubulin基因较其他7个候选基因有较小的平均变异度、稳定值和标准差,为最适宜的内参基因。39、42和45℃高温处理1 h后绿豆象雌雄成虫体内Hsp70表达水平较对照显著上调,当处理时间延长至3 h后,Hsp70基因的相对表达量较对照也有不同程度上调,但差异不显著,表明绿豆象Hsp70基因可以响应高温胁迫,Hsp70蛋白在绿...     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20（GdHsp20.6）完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温（-10~5℃）和高温（35~40℃）处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30~120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

黏虫热休克蛋白Hsp90基因的克隆及不同温度对其诱导反应

热休克蛋白是昆虫体内一种很重要的抗逆蛋白,Hsp90是热休克蛋白家族中的重要成员。本试验利用高通量测序法获得Hsp90的c DNA的全长序列,通过Real-time PCR探讨黏虫各龄期、组织和黏虫3龄幼虫受到不同高、低温胁迫不同时间的Hsp90基因的相对表达量。在黏虫体内得到Hsp90的c DNA全长序列(Gen Bank登录号MF773751)2422 bp,命名为Ms Hsp90,编码717个氨基酸,分子量约为82.576 ku,等电点是4.98,序列包含有Hsp90的保守序列,与鳞翅目夜蛾科的甜菜夜蛾、苜蓿夜蛾、斜纹夜蛾亲缘关系较近,且氨基酸序列相似性都在98%以上。Real-time PCR结果显示黏虫的不同发育阶段和组织中均有Ms Hsp90表达,其中2龄幼虫和后肠的相对表达量最高。40℃处理6 h的相对表达量最高,处理12、24、48 h时,20℃的相对表达量最高。上述分析可知,Ms Hsp90相对表达量的高低表明在黏虫不同组织,不同发育阶段和不同时间、温度处理中发挥的作用存在差异。     

低剂量杀线虫剂对马铃薯腐烂茎线虫三个热激蛋白70 mRNA表达的影响

为了解马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor对低剂量杀线虫剂胁迫的适应机制,采用RTPCR和RACE技术克隆了3个热激蛋白70基因Dd-hsp70-A(KF792307)、Dd-hsp70-C(JQ422276)和Dd-hsp70-F(JQ422277),并利用实时荧光定量PCR分别检测了33℃热激及低剂量(10、1、0.1、0.01和0.001μg/m L)杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理对3个Dd-hsp70基因mRNA表达量的影响。结果表明,3个Dd-hsp70基因在翻译区均含有内含子,编码的氨基酸序列均包含了完整的保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。33℃热激3、6 h及0.1μg/m L涕灭威浸渍处理24 h,马铃薯腐烂茎线虫Dd-hsp70-A基因mRNA表达量分别比对照显著上调1.865、4.127和1.634倍;其它处理的mRNA表达量与对照差异均不显著。证实了Dd-hsp70-A、Dd-hsp70-C和Dd-hsp70-F基因均为组成型,其中Dd-hsp70-A基因的响应在植物线虫应对低剂量杀线虫剂胁迫过程中具有重要作用。     

除草剂对星豹蛛活动行为的影响

为明确除草剂对星豹蛛Pardosa astrigera活动行为的影响,采用药膜法测定乙氧氟草醚、乙羧氟草醚和百草枯3种常规除草剂对星豹蛛的毒力,应用旷野试验法研究除草剂对其活动行为的影响。结果表明:乙羧氟草醚对星豹蛛的LC10为6.75 g/L,乙氧氟草醚的LC10为1.09 g/L,3种除草剂对星豹蛛的毒力顺序为乙氧氟草醚乙羧氟草醚百草枯。高浓度(5.81~10.53 g/L)乙氧氟草醚处理后雄蛛的行走总路程和平均行走速度均较推荐浓度处理(0.07 g/L)显著降低,6.75 g/L乙羧氟草醚处理后雌蛛行走总路程较其余浓度处理显著降低、雄蛛最大行走速度较0.08 g/L浓度处理显著降低,但这2种除草剂各浓度处理均与对照无显著差异;80.00 g/L百草枯处理后雄蛛的行走总路程、最大行走速度和平均行走速度均较对照显著降低,分别为248.48 cm、12.03 cm/s和0.83 cm/s,4.00~20.00 g/L百草枯处理后雌蛛最大行走速度较80.00 g/L处理显著下降。5.81 g/L乙氧氟草醚处理后雄蛛行走区域数显著下降,较对照下降了4.57个,而雌蛛行走区域数则显著升高,较对照增加了2.20个。20.83 g/L乙羧氟草醚处理后雄蛛在中心区域停留时间最短,为0.48 s,占总时间的比例仅为0.16%,5.81 g/L乙氧氟草醚处理后雌蛛在中心区域停留时间最长,为15.94 s,占总时间的比例为5.31%。表明高浓度除草剂处理星豹蛛后对其活动行为影响显著,而推荐浓度处理后对其无显著影响,说明3种除草剂在推荐剂量下对星豹蛛相对安全。     

基于年龄-龄期两性生命表的星豹蛛种群生长发育和繁殖动态分析

为明确温度对星豹蛛Pardosa astrigera生长发育和繁殖的影响,在室内测定17、21、25、29和33℃温度下星豹蛛各发育阶段的发育历期和繁殖力,并构建其年龄-龄期两性生命表,利用构建的生命表分析不同温度下星豹蛛的存活率、繁殖力、寿命期望、繁殖值和种群参数。结果表明,当温度为17~33℃时,随着温度升高星豹蛛成蛛前发育历期呈先缩短后延长的趋势,当温度为25℃时,星豹蛛雌、雄成蛛前发育历期最短,分别为47.8 d和50.5 d;当温度为17、21、25、29和33℃时,星豹蛛雌成蛛第1次繁殖分别于第108天、第63天、第57天、第46天和第60天开始;在17~33℃范围内,随着温度升高,星豹蛛种群特定年龄净繁殖力先升高后降低,29℃时达到最高;在17~33℃范围内,星豹蛛的内禀增长率、周限增长率和净生殖率随温度升高呈先增加后降低的趋势,25℃时达到最大值,分别为0.04 d^-1、1.04 d^-1和9.95;在25~33℃范围内,随温度升高平均世代周期则呈先降低后增加的趋势,在25℃时出现最小值,为54.8 d。表明25℃和29℃分别是星豹蛛种群增长和繁殖的最适宜温度。     

低剂量杀虫剂对星豹蛛捕食桃蚜功能模型的影响

为明确杀虫剂对捕食性天敌蜘蛛对蚜虫控制作用的影响,采用药膜法和点滴法测定了星豹蛛Pardosa astrigera和桃蚜Myzus persicae对4种杀虫剂的敏感性,并利用HollingⅡ捕食功能反应模型分析了杀虫剂作用下星豹蛛对桃蚜的捕食功能反应。结果表明:桃蚜和星豹蛛均对阿维菌素最敏感,其对应的LD₅₀和LC₅₀最低,分别为4.94×10^-4 μg/头和0.14 mg/L;吡虫啉和啶虫脒居中,毒死蜱最低;前三者的LD₅₀依次是毒死蜱的127.47、72.05和1.67倍,LC₅₀依次是毒死蜱的261.36、3.60和4.08倍。杀虫剂处理星豹蛛后对桃蚜的功能反应类型基本符合HollingⅡ模型;除3.0、4.5 mg/L啶虫脒处理外,不同杀虫剂作用下星豹蛛对桃蚜的处理时间长于对照组的0.016 d,最大日捕食量小于对照组的60.7头;同种杀虫剂作用下,随着浓度增加平均日捕食量逐渐降低,处理时间延长,瞬间攻击率下降;寻找效应随着桃蚜密度和杀虫剂浓度的增大而下降。表明低剂量杀虫剂处理星豹蛛后延长了其对猎物的处理时间,降低了瞬间攻击率,减少了日捕食数量,从而降低了对猎物的控制作用。