黄瓜CsHIR1基因表达载体的构建及遗传转化

为了优化黄瓜遗传转化体系以及研究CsHIR1基因在黄瓜中的功能特性,本试验利用In-fusion技术构建植物表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1,经过限制性内切酶SalⅠ和BamHⅠ双酶切检测、质粒PCR检测和测序鉴定,结果表明,表达载体pCAMBIA35S-CsHIR1已构建成功并转入农杆菌GV3101中。以黄瓜抗病种质‘PI197088’和感病种质‘CCMC’的子叶节为外植体,通过优化的农杆菌介导法初步将CsHIR1基因转入黄瓜中,经PCR检测获得25株阳性植株,其中8株阳性植株自交得到种子T1代,T1代PCR检测阳性率为44.7%,实时荧光定量分析表明CsHIR1在T1代阳性株中的相对表达量稍高于对照植株,有1株与对照组的差异较显著,这为进一步研究CsHIR1在黄瓜中的功能奠定了基础。     

Trxf1基因表达载体的构建及在加工番茄中的遗传转化

Trxf1是硫氧还蛋白家族中的一员,是组成硫氧还蛋白系统的重要组成部分,在植物的氧化逆境中发挥作用。为进一步研究该基因功能,通过RT-PCR方法从加工番茄叶片中克隆Trxf1基因的编码区,成功构建植物表达载体pBI121-Trxf1,采用农杆菌介导法转化番茄,经PCR、RT-PCR分析表明,植物表达载体已成功整合到番茄基因组中。实时荧光定量PCR研究表明,加工番茄Trxf1基因在其根、茎、叶、花等器官中均有表达,且在叶片中表达量最高。     

马铃薯StCYP83B1基因过表达载体构建及遗传转化

旨在为解析马铃薯StCYP83B1基因的免疫功能提供重要材料基础,从四倍体马铃薯栽培种‘大西洋’的cDNA中克隆到StCYP83B1基因,将其与融合mCherry标签的35S::pART27重组载体连接,构建p35S::StCYP83B1 mCherry植物过表达载体,并通过农杆菌介导的本氏烟瞬时表达体系确认该蛋白的表达;利用农杆菌介导的马铃薯遗传转化方法,将p35S::StCYP83B1 mCherry转入马铃薯中,随机挑选3株转基因植株进行鉴定：PCR检测证明StCYP83B1已整合到马铃薯基因组中,反转录实时定量PCR检测表明StCYP83B1在转化植株中的转录水平比未转化的对照植株上调40~49倍,免疫印迹检测表明StCYP83B1蛋白可以在转化植株中正常表达。同时,对转化马铃薯植株及微型薯的表型鉴定表明,StCYP83B1过量表达并不影响马铃薯的正常生长发育。该稳定转化马铃薯植株的获得为后续深入解析StCYP83B1基因的免疫功能及作用机制奠定了重要材料基础。     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

甘蓝型油菜WRI1基因cDNA克隆与种子特异性表达载体的构建

WRI1基因所编码的转录因子参与糖酵解和脂肪酸合成,在种子油的积累过程中起着关键作用。在种子中超表达WRI1基因,对提高油菜种子含油量具有重要意义。本研究利用RT-PCR技术,从甘蓝型油菜湘油15号cDNA中分离克隆了5个WRI1基因全长cDNA序列,选取2种存在明显差异(碱基缺失)的cDNA序列构建植物种子特异性表达载体。为后续转基因研究这种差异是否会造成WRI1基因在提高含油量作用上的差异作准备。通过双酶切和连接反应,分别将WRI1基因和napin启动子基因插入到pBI121载体的GUSA基因和CaMV35启动子基因位置。酶切及PCR检测结果显示,napin启动子和WRI1已插入相应位置,完成2种载体种子特异性表达WRI1基因重组载体pBI121+napin+WRI1的构建,命名为pBI121NW2、pBI121NW4。     

静原鸡AK1基因序列分析及真核表达载体的构建

目的 探究宁夏地方品种静原鸡前期转录组测序筛选出的AK1基因编码蛋白的结构与功能,构建其真核表达载体。方法 根据GenBank上已公布的原鸡AK1基因序列,针对其CDS区设计特异性引物,通过克隆测序对AK1基因CDS区SNPs进行快速筛查,构建AK1基因的真核表达载体,并进行编码区生物信息学功能分析。结果 AK1基因编码区全长585 bp,编码194个氨基酸;AK1蛋白无跨膜结构域,存在2个CpG岛,18个磷酸化位点,10个抗原表位,为稳定的水溶性蛋白,空间结构以α–螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位结果显示,AK1蛋白主要位于细胞质内;GO富集分析发现,AK1基因同样富集在细胞质中,与亚细胞定位结果一致。基因共表达分析发现,在与AK1互作的基因中,AK1与AMPD1、PKM2基因存在共表达,共表达系数分别为0.116和0.063。成功构建出AK1-pEGFP-N1载体。结论 该研究结果为后续AK1蛋白功能以及AK1作为肌苷酸相关基因的深入研究提供了科学依据。     

绵羊IGF1基因慢病毒表达载体的构建及其促肌细胞生长作用研究

【目的】克隆绵羊IGF-1基因CDS区,构建绵羊IGF-1基因慢病毒表达载体,分析IGF-1基因在绵羊成肌细胞增殖过程中的作用。【方法】提取绵羊肝组织总RNA,通过RT-PCR方法获得IGF-1全长CDS序列,经测序鉴定后与慢病毒载体pLEX-mcs连接,构建pLEX-IGF-1慢病毒重组表达质粒,并在293T细胞中进行病毒包装和生产。分离培养绵羊原代成肌细胞,并用重组慢病毒使其感染,建立稳定转染pLEX-IGF-1的绵羊成肌细胞系。通过绘制细胞生长曲线,分析过表达IGF-1对绵羊成肌细胞生长的影响;采用流式细胞仪检测细胞周期变化。【结果】克隆获得长518bp的IGF-1CDS区序列。成功构建了pLEX-IGF-1载体,其可在绵羊细胞系中进行稳定表达。通过Western blotting检测显示,IGF-1在293T细胞以及绵羊原代成肌细胞中获得表达,细胞生长曲线显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞生长速度显著加快(第1天差异显著(P0.05),第2~6天差异极显著(P0.01));细胞周期测定结果显示,稳定表达IGF-1的成肌细胞比对照细胞较早进入S期,且在S期的细胞数目比对照细胞多29.35%。【结论】绵羊IGF-1能够有效促进绵羊成肌细胞的生长。     

同步抑制棉籽 FAD2 1 与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因 FAD2 1 与FatB的功能区域片段426与501 bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。     

植物凝集素MNB1基因启动子表达载体的构建及鉴定分析

近年来植物受逆境胁迫的影响日益严峻,而逆境胁迫是造成现代农作物减产的重要因素之一。MNB1基因是拟南芥中与甘露糖高度特异性结合的植物凝集素,具有多种生物学功能,对植物的生长发育及逆境胁迫的应答有着至关重要的调控作用。以拟南芥为试验材料,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术成功构建了ProMNB1:GUS植物表达载体,结合浸花法,成功将ProMNB1:GUS载体转化到拟南芥中,最终通过PCR鉴定分析获得ProMNB1:GUS阳性植株,为研究逆境胁迫下MNB1基因的功能及其转录水平的变化提供了重要的依据。     

牦牛bta-miR-1434-5p和Smad1基因组织表达谱及荧光素酶报告载体构建

为探索牦牛Smad1基因与bta-miR-1434-5p是否存在靶向关系,探究bta-miR-1434-5p分子调控可能机制,利用RT-PCR技术对bta-miR-1434-5p和Smad1 mRNA在牦牛组织中的表达谱进行检测,并构建pmiR-RBREPORTTM双荧光素酶报告载体对牦牛Smad1基因3′端非翻译区(3′UTR)与bta-miR-1434-5p的靶向关系进行研究。结果表明:Smad1基因mRNA在牦牛下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌、淋巴结、卵巢、输卵管、子宫组织中均有广泛表达;bta-miR-1434-5p除在牦牛输卵管中没有表达外,在其他组织均与Smad1基因mRNA共表达;获得牦牛Smad1基因3′UTR序列并成功构建野生型及突变型pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告质粒;荧光素酶活性检测发现bta-miR-1434-5p mimics对Smad1野生型质粒报告荧光没有明显的下调作用,由此推测btamiR-1434-5p与牦牛Smad1基因的该段3′UTR之间未发现明显互作。     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定

【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

跨膜转导肽TAT、9R和牛Sox2融合蛋白原核表达载体的构建与表达研究

【目的】构建pTAT-bSox2-9R融合表达载体,并对其进行原核表达研究,为利用TAT和多聚精氨酸(9R)的跨膜作用实现转录因子蛋白直接重编程牛体细胞提供科学资料。【方法】以GenBank上公布的牛Sox2基因编码区序列为基础,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物;利用PCR扩增方法获得包括Sox2、TAT和9R的重组DNA序列,并将其克隆到空质粒pTAT-HA上,从而构建pTAT-HA-bSox2-9R重组表达载体;将经酶切鉴定和测序验证后的重组表达载体转化大肠杆菌,在不同IPTG浓度和诱导时间等条件下进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。【结果】成功获得bSox2-9R重组序列,成功构建重组质粒pTATbSox2-9R;pTAT-bSox2-9R在0.6mmo/L的IPTG于37℃诱导4h的条件下表达目的蛋白约36ku,经Western blot验证为目的蛋白。【结论】成功获得了pTAT-bSox2-9R融合蛋白,为多聚精氨酸蛋白转导域(PTD)介导的转录因子蛋白直接重编程黄牛体细胞以获得诱导多潜能干细胞的研究积累了原始资料。     

中国水仙ZDS反义基因表达载体的构建与转基因植株的获得

【目的】构建中国水仙ZDS反义基因表达载体,为进一步研究ZDS基因的功能、改良中国水仙花色、培育花色新品种提供参考。【方法】以中国水仙花为材料,采用RT-PCR方法克隆其ZDS基因,通过PCR、双酶切、连接等方法将ZDS基因反向互补插入到pCAMBIA1301双GUS植物表达载体中,构建ZDS反义基因表达载体P1301-ZDS,再通过冻融法将重组质粒P1301-ZDS导入根癌农杆菌。采用根癌农杆菌介导法将ZDS反义基因转化中国水仙带盘鳞茎,通过直接、间接、延迟筛选法3种方法对侵染的带盘鳞茎进行抗性筛选,采用直接筛选法和逐步降低选择压(质量浓度)方法对抗性鳞茎进行增殖和分化培养,采用GUS组织化学和hyg基因的PCR检测方法对中国水仙转基因植株进行鉴定。【结果】成功构建了中国水仙ZDS反义基因表达载体P1301-ZDS;延迟筛选法为根癌农杆菌侵染带盘鳞茎的有效筛选方法,转化效率达到28.54%;逐步降低选择压法为抗性小鳞茎增殖和分化培养的有效培养方法;将65株抗性小苗在1/2 MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Hyg+100mg/L Cef生根培养基中培养,获得了12株再生植株,转化率达到18.46%;检测结果表明,10株抗性植株hyg基因和gus基因已经整合到中国水仙的基因组中并稳定表达;1株抗性植株稳定表达hyg基因但gus基因未稳定表达,1株抗性植株2个基因均未稳定表达。【结论】构建中国水仙ZDS反义基因表达载体并侵染中国水仙带盘鳞茎,经抗性筛选后获得12株中国水仙转基因植株。