大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子在黑龙江省土壤中的越冬存活率

为探究大豆疫霉Phytophthora sojae卵孢子在黑龙江省土壤中的越冬存活率及其与所处土壤深度和媒介的相关性,以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,将培养基及病残体中的大豆疫霉卵孢子分别接种到试验田框栽土壤表层下不同深处,检测其卵孢子的越冬存活率,同时在框栽中定量播种不含任何已知抗疫霉根腐病基因的大豆品种Sloan(rps),苗期调查其发病率。结果表明,大豆疫霉卵孢子在黑龙江省土壤中的适生性较强,可在5~15 cm深度土壤中安全越冬,越冬存活率高达81.67%~96.33%。卵孢子越冬存活率与其所处的越冬媒介关系不大,而与土壤深度有关。在5~15 cm范围内,随着土壤深度的增加,卵孢子越冬存活率增加。处于深层土壤中的卵孢子更容易打破休眠,进入萌发前的萌动状态。各处理间卵孢子越冬存活率的显著性差异并未在发病率上表现出来,说明除了土壤深度外,还有其它因素影响发病率。     

大豆疫霉卵孢子致死温度的测定

大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)侵染引起的、危害极其严重的最具毁灭性的大豆病害之一.病原菌以卵孢子在土壤中越冬,在条件适宜时导致下一年大豆发生根茎腐烂.病原菌卵孢子也可以存在于患病种皮内,但其在病害循环中的作用还不清楚.卵孢子是大豆疫霉的主要传播方式.本研究中对大豆疫霉卵孢子的致死条件进行了筛选.结果表明,使用60℃湿热处理大豆疫霉卵孢子20min或80℃干热处理大豆疫霉卵孢子20min,其萌发率为0,且死亡率为100%.     

掘氏疫霉卵孢子萌发研究

 掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)种内菌株直接交配产生的卵孢子分别用0.1% KMnO₄处理20分钟和0.3% H₂O₂处理2分钟在S+L培养基上(26℃)培养7天萌发率>70%。H₂O₂是本研究首次报道的一种刺激掘氏疫霉卵孢子萌发的处理剂,其效果略优于KMnO₄。用KMnO₄和H₂O₂处理均可有效地抑制卵孢子悬浮液中菌丝片段及菌丝膨大体的萌发生长。在一定时期内卵孢子萌发率随卵孢子保存时间的增加而增加,保存30天和45天的卵孢子分别用KMnO₄和H₂O₂处理萌发率最高。卵孢子保存期间有无光照对萌发率无显著影响,但卵孢子荫发时给予光照对萌发有明显的促进作用,保存30天的卵孢子在光照下萌发率为60-70%,在黑暗中仅0-16%。卵孢子萌发过程中的光照条件以黑光灯8小时,日光灯16小时交替连续照射7天效果最好,其次为黑光灯单独连续光照,以日光灯单独照射效果较差。所测定的6种培养基中以S+L培养基对卵孢子萌发的效果最好,其次为V₈+L和WA+L。蜗牛酶、纤维素酶、土壤浸出液和黄瓜果提取液对掘氏疫霉卵孢子萌发无明显刺激作用。     

大豆疫霉RNA结合蛋白PsM90的基因功能研究

 真核生物的基因表达能够在转录与转录后等水平受到调控,以适应不同时空环境中的生长与发育等生物学过程,其中PUF家族RNA结合蛋白是一类具有保守PUM-HD(Pumilio homology domain)功能域的转录后调节因子,通过与靶标mRNA特异性结合控制其稳定性及翻译。本研究利用CRISPR/CAS9介导的疫霉菌基因组编辑技术,对大豆疫霉的PUF家族基因PsM90进行敲除和功能研究。结果表明,PsM90敲除突变体的卵孢子产量减少至野生型的32%,卵孢子壁明显变薄,卵孢子中的细胞器未能正常分化;游动孢子对大豆黄化苗下胚轴的致病力有所下降。此外,PsM90的敲除不影响营养菌丝生长、孢子囊发育、游动孢子释放和休止孢萌发等生物学性状。上述结果揭示了PsM90是大豆疫霉有性发育等过程的重要相关基因,为深入揭示卵菌中卵孢子发育这一独特生物学过程的分子调控机制奠定了基础。     

影响大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)游动孢子产生的条件

 间歇性地给菌丝块换水可以诱导菌丝产生孢子囊,进而释放游动孢子。挑取5~8块直径为8mm于利马豆或V₈汁平板上培养4~8d的菌块,置于直径7cm的培养皿内,加入蒸馏水正好没过菌块表面,每30 min换水一次,换水4次后加入15 ml Petri培养液,25℃、黑暗条件下培养18~20 h,可诱发菌块大量产孢。     

掘氏疫霉卵孢子在田间越冬的研究

 掘氏疫霉Phytophthora drechsleri Tucker phy-5 A1型与phy-64A₂型配对培养,在VA培养基上产生的卵孢子数量最多。卵孢子在15cm深土壤中,经过1988-1989年冬季,存活率为82.95%。卵孢子连同VA培养基制成悬浮液,白天散光照射、夜间黑暗比全部黑暗萌发率高;加土壤浸渍液比加蒸馏水萌发率高。     

大雄疫霉与大豆疫病

前言大雄疫霉为藻菌纲、霜霉目、腐霉科、疫霉属真菌的一个种。在近代分类史上,真菌学家们虽根据其孢子形态和致病性等对此菌进行了多次分类与修订,在种内又区分出几种形态和致病性不同的类型,而大豆疫病菌仅是其中的一种。伴随着大雄疫霉菌的分类进展,致使大豆疫病菌的命名也发生了相应的变化:由Phvtophthora megasperma 发展为 P.     

大豆疫霉根腐病

 大豆疫霉根腐病是毁灭性病害之一,在我国近年有加重发展趋势。美国、澳大利亚和加拿大对Phytophthora sojae及大豆抗性研究较多,目前已建立了完善的生理小种体系,分离了30多个生理小种,最新定名小种为38和39号。RFLP研究表明,P.sojae的多数变异都可在小种1,7,17和19号中表现出来,因而推测其它小种可能是从这4个小种杂交派生而来,澳大利亚的P.sojae由美国传入。抗、耐病筛选方法有田间筛选法、接种体薄层法、斜板法、下胚轴接种法和豆荚接种法等。选出不少抗病材料,通过遗传研究定名了抗性基因Rps1、Rps-b、Rps-c、Rps1-d、Rps1-k、Rps2、Rps3、Rps3-b、Rps3-c、Rps4、Rps5、Rps6和Rps7等。Rps1-k是目前应用较广的抗性基因,它能抗20多个生理小种。抗性基因Rps1和Rps1-c从被利用到丧失抗性大约是8~10年的时间,按此推算几年之内Rps1-k基因也将丧失抗性,因此主张抗病基因和耐病基因结合使用,不同抗性基因结合使用。     

大豆疫霉卵孢子微量、快速检测方法的建立

采用套筛富集人工接种于土壤中的大豆疫霉卵孢子。结果表明,当接种量为104、103、102、101、100时,富集百分率分别为45.9%、39.6%、11.8%、1.7%、5.6%。采用玻片压碎法提取微量卵孢子中DNA后,采用PCR技术快速进行检测的结果表明,提取10,5,1个卵孢子中DNA进行PCR扩增成功率分别为83.3%、33.3%、0。提取10个卵孢子中DNA进行PCR扩增时,2个处理出现非特异性PCR产物。内切酶MspI能将特异性PCR产物消化为204bp和124bp两个片段;内切酶RsaI能将特异性PCR产物消化为242bp和86bp两个片段。     

大豆疫霉和大豆疫病

大豆疫霉和大豆疫病彭金火谭红赵改萍（大连动植物检疫局大连１１６００１）（国家动植物检疫局北京）由疫霉引起的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）根腐和茎腐病（大豆疫病）于１９４８年最先见于美国的印第安纳州,公开报道则在１９５５年。Ｋａｕｆｍａｎｎ＆Ｇｅｒｄ...     

增强型绿色荧光蛋白基因转化大豆疫霉菌及其表达

为了探讨大豆疫霉菌Phytophthora sojae的侵染过程及其在土壤中的生态学,采用CaCl2-PEG介导的原生质体转化方法,将外源增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转化到大豆疫霉菌中,观察EGFP基因在大豆疫霉菌不同生育时期的表达,对转化子中的EG-FP基因进行PCR检测,并对转化子的生长、发育及致病性进行测定。结果显示,EGFP基因能够在大豆疫霉菌菌丝、游动孢子囊和卵孢子中稳定表达,并在475 nm蓝光激发下发出绿色荧光;转化子的菌丝生长速率与野生型无显著差异,个别转化子在无性繁殖和有性生殖方面与野生型有显著或极显著差异,其中一个转化子的致病型发生了改变。研究表明获得的EGFP基因转化子可以作为研究大豆疫霉菌侵染及定殖的材料。     

大豆疫霉细胞凋亡相关基因的鉴定与表达分析

为探讨大豆疫霉Phytophthora sojae细胞凋亡潜在的调控机制,根据已知的细胞凋亡蛋白,利用在线工具BLASTP、pFAM和SMART在大豆疫霉蛋白组数据库中鉴定细胞凋亡同源蛋白并构建其进化树,通过转录组数据和实时荧光定量PCR技术分析细胞凋亡相关基因在大豆疫霉生长、发育及侵染不同时期的表达情况。结果显示:在大豆疫霉中共鉴定到13个细胞凋亡同源蛋白,包括核酸内切酶G(PsNUC1)、细胞色素c(PsCYCS)、凋亡诱导因子(PsAIF)、丝氨酸蛋白酶(PsHtrA-1、PsHtrA-2和PsHtrA-3)、多聚ADP核糖聚合酶(PsPARP-1、PsPARP-2和PsPARP-3)和TatD核酸酶(PsTatD1、PsTatD2、PsTatD3和PsTatD4)。在进化上,PsNUC1、PsCYCS、PsAIF、PsHtrA-1、PsPARP-1、PsPARP-2、PsPARP-3、PsTatD1和PsTatD2与人及秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的同源蛋白亲缘关系较近,而与真菌相关蛋白亲缘关系较远,PsHtrA-2、PsHtrA-3、PsTatD3和PsTatD4与酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae相关蛋白相似度更高,说明大豆疫霉细胞凋亡蛋白在进化中发生了较大变异。大豆疫霉细胞凋亡相关基因PsHtrA-1和PsRARP-1在孢子囊阶段诱导表达,PsHtrA-2和PsRARP-2在游动孢子阶段上调表达,PsAIF、PsHtrA-3、PsRARP-1和PsRARP-2在侵染阶段明显诱导表达,PsCYCS在侵染阶段下调表达。细胞凋亡相关基因在大豆疫霉不同阶段的表达模式有较大差异,说明细胞凋亡在大豆疫霉生长、发育及致病过程中具有重要作用。     

非寄主和寄主种子分泌物对大豆疫霉活性的影响

为探寻非寄主和寄主种子分泌物中抗病信号分子,通过显微观察,采用菌丝生长速率法和离体接种法对不同种子分泌物处理后大豆疫霉Phytophthora sojae的游动孢子数、孢子囊数、游动孢子释放后残留的空囊数、成囊和未成囊的游动孢子数、萌发和未萌发的胞囊数、菌落直径、卵孢子数进行测量,并计算抑制率,明确非寄主菜豆和寄主大豆抗病品种、感病品种种子分泌物对大豆疫霉游动孢子趋化性、生长发育和侵袭力的影响。结果显示,非寄主菜豆种子分泌物不吸引大豆疫霉游动孢子,显著抑制大豆疫霉孢子囊形成、胞囊萌发和卵孢子产生,抑制率依次为97.3%、73.0%和17.5%,然后溶解胞囊,最终导致游动孢子对下胚轴侵袭力降低,抑制率为67.1%。寄主大豆种子分泌物能吸引大豆疫霉游动孢子,感病品种种子分泌物吸引力高于抗病品种。感病品种种子分泌物对大豆疫霉生长发育无显著影响,但促进大豆疫霉游动孢子侵袭力;抗病品种种子分泌物显著抑制大豆疫霉孢子囊形成、胞囊萌发和卵孢子产生,抑制率依次为86.6%、34.3%和12.8%,然后溶解胞囊,但作用强度小于非寄主菜豆种子分泌物,最终导致游动孢子对下胚轴的侵袭力降低,抑制率为24.2%。表明非寄主菜豆和寄主大豆抗病品种的种子分泌物对大豆疫霉有抑菌活性,大豆疫霉的非寄主和寄主抗病性与种子分泌物有关。     

大豆中疫霉诱导性GmDRRP基因启动子的克隆与功能分析

本研究根据大豆与疫霉互作的基因芯片数据,筛选了一个受疫霉诱导表达的大豆抗病相关基因(Gm DRRP,glycine max disease resistance response protein),并对其启动子响应疫霉侵染的功能进行了研究。序列分析表明该基因编码一个大豆抗病相关蛋白。分别用SA、Me JA、ABA、ETH和GA3五种激素处理后,发现该基因的表达受激素的抑制。克隆其转录起始位点上游1 590 bp的启动子区,生物信息学分析发现该区域包含多个已知与逆境响应相关的顺式元件。进一步将启动子构建在融合Gus报告基因的植物表达载体上,分别瞬时转化烟草和稳定转化大豆根毛,并检测了Gus报告基因的表达情况。结果表明,Gm DRRP启动子均能在两种体系中不同程度的受疫霉诱导,其表达模式为接种后0.5 h被快速诱导,并在2 h时显著提高。根据生物信息学对顺式元件的预测结果,对启动子进行了分段分析,获得了一个222 bp的小片段,其疫霉诱导表达能力是全长启动子的34%。以上结果表明大豆的Gm DRRP启动子能被疫霉快速诱导。     

Induced distal defence potentiation against Phytophthora sojae in soybean

Soybean phenylpropanoid defence responses to the wall glucan elicitor (WGE) fromPhytophthora sojae include the accumulation of phenolic polymers and glyceollin in cells immediately proximal to the point of treatment and the accumulation of conjugates of the isoflavones, daidzein and genistein, in distal cells. Since daidzein is a glyceollin precursor and genistein is both toxic to P. sojae and implicated in local potentiation of competency for the glyceollin response, it has been hypothesized that the distal cell response might raise the defence potential of cells distant from the infection court. In this paper, it is demonstrated that the WGE is indeed highly effective in protecting cells distal to the point of treatment from infection by P. sojae. Mycolaminaran, jasmonic acid (JA), methyl jasmonate and the ethylene precursor, 1-amino-cyclopropane carboxylic acid (ACC), are also effective, while salicylic acid (SA) is not. Methyl jasmonate, WGE and mycolaminaran are most effective, resulting in nearly complete protection against the pathogen even in the universally susceptible line, Williams. Dose response data revealed two distinct types of protection shared by all treatments. The first contains the pathogen to the point of inoculation, while the second is lesion limiting. Lesion limiting protection correlates very well with pre-infectional levels of genistein conjugates and accumulation of a specific peroxidase isozyme, P 2-4, and with post-infectional accumulation of glyceollin, suggesting that this type of protection may be the result of a distal potentiation of glyceollin elicitation competency. The mechanism underlying local containment protection is unknown, but it does not correlate well with any of the established phenylpropanoid responses.     

棉隆对辣椒疫霉病的防效及对土壤微生物群落的影响

为明确不同剂量棉隆对辣椒疫霉的防效及对土壤微生物群落的影响,在温室大棚条件下采用密封熏蒸法测定了不同剂量(300、450、600和750 kg/hm2)棉隆土壤熏蒸对土壤疫霉病菌的抑制率及田间防效,并采用Biolog法研究了其对土壤微生物功能多样性的影响。结果表明,不同剂量棉隆在熏蒸后揭膜当天(0)、80、140 d对辣椒疫霉病菌的抑制率分别为86.84%~100%、75.26%~96.37%和73.24%~95.46%;且80、140 d时对辣椒疫霉病的防效分别为77.19%~96.49%和70.00%~93.33%;在棉隆熏蒸揭膜当天各剂量处理下微生物对碳源的利用(用平均每孔颜色变化率表示)以及微生物多样性指数中的丰富度指数、均匀度指数及Mc Intosh指数均显著低于对照,而Simpson指数显著高于对照,随着试验时间的延长,各剂量对其影响逐渐减小,但高剂量尤其是750kg/hm2处理在140 d时仍与对照差异显著。表明棉隆剂量越高对辣椒疫霉病的防效越显著,对微生物活性影响越大,高剂量处理能明显抑制土壤微生物的活性,降低土壤微生物的多样性。     

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。     

Pathogenicity and RAPD analysis of Phytophthora nicotianae pathogenic to pepper in Tunisia

Nine isolates of Phtophthora nicotianae were isolated from infected pepper plants. Their pathogenicity was studied in Capsicum annuum in comparison with P. nicotianae isolates from tomato and tobacco. The pathogenicity test showed that pepper isolates of P. nicotianae are adapted to their host. Banding patterns obtained by RAPD analysis with six oligonucleotide primers revealed polymorphism that grouped the isolates independently of the plant host. The polygenic dendrogram showed that pepper isolates were more similar to tomato isolates than to tobacco isolates. The RAPD bands of 1300 and 1500 bp, detected with primers OPD-01 and OPD-10, respectively, appeared specific to the most pathogenic pepper isolates. The OPK-08-1950 seems specific to the isolates of P. nicotianae from tomato. These results suggest that host specified might occur in P. nicotianae and that may be due to interspecific hybridization events resulting in novel pathogenic behavior.