禽传染性支气管炎病毒免疫原基因的PCR获取及其酶切鉴定

分绍用ＲＴ－ＰＣＲ（反转录－聚合酶链反应）获取禽传染性支气管炎病毒Ｍ４１株和广东地方致弱株Ｄ４１免疫原（Ｓ１）基因的详细方法，所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列，跨幅为１．７ｋｂ，结果表明，两株病毒所获的ＰＣＲ产物与预期的一致；用此对引物，以ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物为模板，扩增出一样的ＤＮＡ片段，试验还显示，国内外几家公司有关ＲＴ和ＰＣＲ的分子生物学试剂可以兼用     

胰岛素突变体合成中不对称PCR条件的探讨

在胰岛素定点突变体合成中，对不对称PCR反应中突变位点的引物和末端引物的比例以及退火温度进行优化。结果表明：PCR反应5′末端引物与突变引物的配比为50：1～100：1；第2轮PCR反应退火温度在65～70℃较为理想。     

RT—PCR和核酸探针在IBV检测中的应用

用ＰＣＲ和核酸探针杂交检测了３种毒株在鸡胚中的繁殖动态及人工感染鸡和自然感鸡气管粘液及肾组织内的ＩＢＶ,结果表明：在胚鸡中繁殖３种毒株ＩＢＶ（Ｈ１２０,ＨＫ,Ｍ４１）及,ＰＣＲ最早检出时间２０－２４ｈ,克隆探针最早检出时间为２４－３０ｈ;用克隆核酸探针检测人工感染鸡,１２ｈ后能从肾脏中检出病毒。对７只就诊鸡的病变肾脏进行杂交检测和ＰＣＲ扩增,有５中均呈阳性反就     

Mab-ELISA对IBV毒株定性检测方法

针对禽传染性支气管炎病毒（IBV）血清型众多、临床检测不易的难题，用我国自已研制的2株IBV单克隆体，通过多种方法的比较与鉴定，建立起活用于定性检测IBV的包被鼠源IBV单抗的Mab-ELISA方法，其操作程序是：包被鼠源IBV单抗－被检测病毒－鸡抗IBV高免血清－兔抗鸡IgG(AGP效价1：32）－羊抗兔IgG-HRP;用本方法对国内46个IBV分离株及NDV、AIV－H9N2、PPMV－I等的检测，表明其具有较好的特异性和敏感性。     

我国允传染性支气管炎病毒地方分离株的形态观察和S1基因的RT—PCR扩增

参照了已表的ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株全基因组序列,自行设计合成了３和引物（ｙｏｕｌ＋、ｙｏｕ２－ｙｏｕＭ＋）,引物ｙｏｕ１＋和ｙｏｕ２－在Ｓ１基因两侧,跨幅约１６１０ｂｐ,引物ｙｏｕ２－和ｙｏｕＭ＋在Ｓ１基因的３’端,跨幅约５３０ｂｐ。用这两对引物对５个ＩＢＶ地方分离株（ＨＮ２,ＨＮ４,ＪＸ１,ＳＣ２和ＳＣ１）进行ＲＴ－ＰＣＲ,均成功地扩增出相应大小的目的片段。病毒在电镜下观察中以形态多变的冠状病毒粒子。     

鸡传染性支气管炎病毒D41株S1基因部分序列的测定

通过反转录及变退火温度ＰＣＲ方法扩增出含先导序列的ＩＢＶ广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ,长度约１．７ｋｂ．利用双脱氧链终止法对其５′端测序,准确读到３４２个碱基,并确定了翻译起始密码子ＡＴＧ的位置．     

禽传染性支气管炎病毒S1基因植物表达载体的构建

以含传染性支气管炎病毒（ZJ971毒株）S1基因的质粒PBS为模板,根据其序列设计引物进行PCR扩增,得到1.7kb左右的S1基因产物；用XbalI和BamHI酶切纯化，并在T4DNA连接酶的作用下，定向克隆到植物表达载体PBI121中,PCR及酶切鉴定表明，质粒经三亲交配已导入根癌农杆菌中。     

IBV陕西分离株人工感染雏鸡的临床病理学研究

用ＩＢＶ陕西分离株Ｘ，Ｆｕ，Ｗ和Ｈ株人工感染４０日龄和１９日龄的雏鸡复制人工病例，对其临床症状、大体病变和病理组织学变化进行了较详细的研究。结果表明，ＩＢＶ陕西分离株具有较强的致病力，不仅能引起雏鸡发生呼吸道症状，而且可致严重的肾脏损伤，对１９日龄鸡引起的临床症状和病理损害均比４０日龄鸡更为严重。感染４０日龄和１９日龄鸡后，潜伏期、致死雏鸡的时间与病程分别为３８￣７２ｈ和３２￣４０ｈ，９６ｈ和４８     

IBV S1基因RT—PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５‘端加有不同酶切位点的ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子。     

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物同归试验和m清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV.采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析.结果表明,分离株HeNan10/08与BJ株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%.     

含有IBV S1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８－Ｓ‘１．Ｈｏｌｔｅ为材料,分别构建了可表达ＩＢＶ Ｓ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）,ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列为融合短肽）,ｐＡｃＧＨＬ－Ｃ－Ｓ１,Ｈｏｌｔｅ。     

IBVS1基因RT－PCR产物的分子克隆

报道了在两条引物的５′端加有不同酶切位点的ＩＢＶＤ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物与ｐＵＣ１８进行分子克隆的研究情况。采用自己改进的微量基因克隆的方法，经回收的插入片段的分子量大小及ＨａｅⅢ酶切分析，证明获得了两株重组质粒转化子     

反向被动血凝检测鸡传染性支气管炎病毒的研究

本文首次报道一种快速检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的反向被动血凝法(RPHA),并对其特异性、敏感性和实用性进行了探讨。还用该RPHA法比较了不同纯度抗原制备的抗体的免疫学特性和应用价值。最后,对单克降抗体(McAb)用于RPHA的可能性也进行了一些试验。 结果表明:1.用RPHA法检测IBV有快速、敏感、简便而准确的优点;2.病毒抗原经一次超速离心处理,即可达到RPHA的要求,3.抗体谱较窄或效价较低的McAb,可能不适用于IBV的RPHA方法。     

应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

利用聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｃｎ，ＰＣＲ）技术检测沙门氏菌。根据沙门氏菌鞭毛素Ｉ相抗原基因，设计了一对各长２０个碱基的引物，扩增２６９ｂｐ的片段。并用８个标准标沙门氏菌株和３个阴性菌株检查引物特异性，结果完全相符。采用５０μＬ体积，ＮＴＰｓ２００μｍｏｌ，引物各１μｍｏｌ，ｍｇ＋＋３ｍｍｏｌ，Ｔａｑ酶２Ｕ。循环温度为９７℃７ｍｉｎ予变性后；９４℃１ｍｉｎ，６０℃１ｍｉｎ，３５个循环后再延伸７２℃７ｍｉｎ。经电泳分析，灵敏度可达每毫升检出１０４个细胞，经二次扩增后，灵敏度还可提高。实验共检查了３０个可疑样品，检出率明显高于生化检查和免疫学方法检查。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株与疫苗株抗原相关性和S1基因序列分析

本实验挑选8株近年来山东省IBV分离株与疫苗株H120和491,利用SPF鸡分别制备了高免阳性血清,进行鸡胚交叉中和试验,计算其抗原相关系数,鉴定其血清型,并结合S1基因序列分析,研究其血清型和基因型之间的关系.结果显示:SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701与疫苗株H120同属Mass血清型的不同亚型,其它5个分离株与H120和491不属于同一个血清型.结合S1基因序列分析发现,S1基因序列分析与血清中和结果二者不具有明显的相关性,8个分离株分属三个基因群,其中SDTA06111与H120等同属一个基因群,但血清中和实验显示它们不属于一个血清型;CK/CH/SD09/005与一个参考株独自构成一个基因群,其S1基因变异程度较大,并且能够与两个疫苗株发生交叉中和实验,但不属于一个血清型,它可能是一个基因重组后病毒.     

鸡传染性支气管炎(IB)诊断方法的研究

本试验用鸡胚大量繁殖鸡传染性支气管炎病毒（IBV）,收集尿囊液,用1％胰蛋白酶处理制备IBV血凝抗原,建立了血凝—血凝抑制（HA—HI）检测IBV抗体的方法,其特异性强、操作简便。另外,本试验建立Dot—ELISA方法用于检测IBV,病料经处理后,点样于硝酸纤维素膜,加兔抗IBV抗体,经PPA—DAB—H_2O_2系统显色,其检测结果与双抗体夹心ELISA的检测结果一致。两种诊断方法的建立为临床上检测病原和监测抗体提供了便捷的手段。     

甘蔗白条病(Xanthomonas albilineans)PCR检验技术研究

应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术检测甘蔗茎白条病无症样品和细菌纯培养及ＤＮＡ,并以改良半选择培养基（ｍＸＡＭ）加以验证。结果表明,ＰＣＲ能特异性地检出白条黄单胞包括标准菌株３３９１５ＡＴＣＣ和血清型Ⅰ,Ⅱ等１９个菌株。但不能扩增其它５个分离自蔗茎的腐生黄单胞和１３个其它属种的植物细菌。能够检出少至１０ｐｇ靶细菌的总ＤＮＡ或２０个活细菌。ＰＣＲ检测灵敏度较ＥＬＩＳＡ和ＤＩＡ高１００～１０００倍。田间样品检测结果与实际发病符合度为９３．４６％。该项技术适用于国内外甘蔗种质资源交换和口岸检疫以及病害流行学研究。     

PCR方法进行牛Y—DNA特异性片段的分子克隆

本研究应用聚合酶链反应扩增牛Ｙ染色体特异性ＤＮＡ片段,从宰后成年公,母牛肝提取ＤＮＡ,分别俄为ＰＣＲ扩增模板,扩增产物电泳结果,公牛样品具有特异性ＤＮＡ扩增谱带,而母牛样品则没有扩增带,以ｐＵＣ１８为载体,将扩增片段构建成牛Ｙ特异性的部分Ｙ染色体文库。本实验所克隆的牛Ｙ特异性ＤＮＡ片段可以作为奶牛胚胎性别鉴定的探针ＤＮＡ。