ST细胞全悬浮培养的驯化及其培养伪狂犬病毒的工艺研究

将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×10⁶/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×10⁶/mL~3.0×10⁶/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。     

BHK-21细胞规模化培养鸡新城疫病毒工艺的研究和初步应用

为了实现鸡新城疫病毒HN2018株(基因Ⅶ型)在乳仓鼠肾(BHK-21)细胞上的无血清规模化培养，本试验采用悬浮培养技术驯化和筛选了1株能够稳定传代的BHK-21-xh悬浮细胞株；使用该细胞以初始密度为100×10⁴个/mL接种摇瓶进行培养，并对摇瓶培养鸡新城疫病毒HN2018株的接毒细胞密度、培养温度、接毒量、收毒时间等工艺参数进行摸索和优化；利用摇瓶优化的病毒培养工艺，在10和100 L生物反应器中逐级放大培养BHK-21-xh悬浮细胞，接种鸡新城疫病毒；采用生物反应器悬浮培养的鸡新城疫病毒HN2018株细胞毒与鸡胚毒分别制备成灭活疫苗，免疫SPF鸡进行免疫效力的比较。结果显示，在摇瓶中培养72 h细胞密度均不低于800×10⁴个/mL,细胞活率均不低于96%;按照BHK-21-xh细胞密度不低于800×10⁴个/mL,病毒感染复数(MOI)为0.216进行接毒，同时添加终浓度为20μg/mL的胰蛋白酶，于35℃温度条件下培养64～72 h收获病毒液，鸡新城疫悬浮培养细胞毒红细胞凝集(HA)效价最高能够达到10log...     

基于生物反应器的猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)悬浮培养工艺研究

为了优化生物反应器全悬浮培养技术制备猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的工艺,试验首先通过摇瓶培养对病毒接种时的细胞密度、胰酶浓度、接毒剂量和收毒时间等培养条件进行优化;之后按照摇瓶培养确认的工艺进行生物反应器全悬浮培养工艺验证,同时对pH值、溶氧值(DO)、转速等培养参数进行优化,以病毒含量(TCID₅₀)为指标,最终筛选出在15L生物反应器中培养猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)的最优条件,并进一步在50L生物反应器中进行工艺验证,将病毒液灭活后稀释至1×10^7.0 TCID₅₀/mL免疫怀孕75～90d的健康易感初怀母猪,在分娩当日,采集母猪和仔猪血清,并对分娩的3日龄仔猪攻毒进行免疫原性试验。结果表明：猪流行性腹泻病毒(ZJ/15株)在摇瓶上的最适培养条件为当细胞密度达到6×10⁶ 个/mL以上时,用含胰酶(终浓度为20μg/mL)的无血清培养基将细胞密度稀释至2×10⁶ 个/mL,按感染复数(MOI)=0.1接毒,130 r/min摇床振荡培养36h可收获病毒液,病毒含量...     

犬细小病毒悬浮培养工艺研究

研究旨在证明犬细小病毒(CPV)悬浮培养的可能性,提高CPV P6株抗原的病毒含量,降低转瓶生产不同批次间疫苗质量差异,生产质量稳定的疫苗产品。试验利用大孔的纤维编织物BioNOCⅡ型微载体所提供的巨大表面积,实现Vero细胞高密度培养,建立了Tide-cell生物反应器大规模培养CPV P6株抗原制备工艺。结果显示：生物反应器Tide-cell载体罐内接入1.0×10¹⁰个F81种子细胞,在优化的参数条件下培养,用RPMI 1640培养液经过96 h培养,细胞总数为1.0×10¹¹个;在葡萄糖消耗量约为5 g/(L·h)时,按照病毒感染复数(MOI)=0.02将生产种毒CPV P6株接入Tide-cell微载体细胞培养瓶内,补加含8%血清的RPMI 1640病毒维持液至50 L,调整pH值为7.2～7.3,培养48 h收获,病毒含量至少为10^7.43 TCID50/mL。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

无血清悬浮培养PK-15细胞及其对猪圆环病毒2型增殖的影响

【目的】 建立基于无血清悬浮培养PK-15细胞生产猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗的工艺，提高PCV2疫苗生产效率，降低PCV2疫苗生产成本。【方法】 首先采用直接驯化法对贴壁生长的PK-15细胞进行无血清悬浮培养驯化，并在无血清悬浮培养体系下，采用连续传代的方法考察驯化成功的PK-15细胞的传代和生长稳定性。研究不同感染复数（MOI）（0.10、0.05、0.01和0.001）和不同PK-15细胞接种密度（CDI）（1.0×10⁶、3.0×10⁶、5.0×10⁶/mL）对PCV2增殖的影响，同时对感染病毒前后的细胞培养液中葡萄糖、氨基酸及代谢副产物乳酸和氨进行初步分析。【结果】 贴壁PK-15细胞经过30 d的直接驯化可以快速适应无血清悬浮培养，且驯化过程中细胞平均比生长速率由0.1 d^-1增加到0.6 d^-1；悬浮PK-15细胞可以至少连续稳定传15代，连续传代过程中平均比生长速率在0.6 d^-1附近波动，且细胞活率始终>90%；以1.0×10⁶/mL接种，第4天可达到峰值活细胞密度6.2×10⁶/mL，并可维持1 d，第4天前活率均>90%，此后快速下降；病毒增殖最佳工艺参数为：感染复数为0.05，细胞接种密度为1.0×10⁶/mL，最终收获时病毒滴度可达10^6.2TCID₅₀/mL；对细胞感染前后的代谢分析发现，病毒感染后细胞对葡萄糖和多数氨基酸代谢快于感染前，且感染组在感染后72 h附近出现葡萄糖和谷氨酰胺耗竭并伴随代谢副产物乳酸和氨快速积累，之后细胞改变代谢途径并利用乳酸。【结论】 30 d的直接驯化可以获得悬浮PK-15细胞株，PK-15细胞可用于PCV2增殖，结果可为大规模无血清悬浮培养PK-15细胞生产PCV2疫苗提供一定理论和实践基础。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型油乳剂灭活疫苗的研制

为研制鸡Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)油乳剂灭活疫苗,试验采用鸡肝癌细胞(LMH)扩增FAdV-4,测定FAdV-4最佳灭活条件和疫苗最佳油水比,研制了FAdV-4油乳剂灭活苗。按《中华人民共和国兽药典》进行疫苗质量、安全性和临床效力检验。结果显示:LMH细胞接种FAdV-4 72h后其毒力最高,TCID50=10-7.78/0.1mL;终浓度0.15%的甲醛溶液37℃24h可灭活FAdV-4;油水比为2∶1的疫苗性状最稳定,质量和安全性检验均合格;疫苗最小免疫剂量为0.4 mL/只;抗体水平在免疫后第2周开始上升,第4周达到最高,而后缓慢下降。对疫苗免疫鸡14 d后注射0.2 mL FAdV-4病毒液(含10-5.78TCID50/0.1 mL),经14 d观察可见鸡全部存活,剖检后无病理变化且攻毒后第3、5、7、10、14天PCR检测均为阴性,临床保护率为100%。研究提示:LMH细胞可有效提高FAdV-4毒价,通过优化FAdV-4灭活条件和疫苗油水比,所研制的疫苗安全性高,保存期长,能有效预防FAdV-4感染,为鸡心包积液综合征防控提供参考。     

BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究

为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。     

猪瘟疫苗微载体悬浮培养生产工艺试验

为优化猪瘟病毒(CSFV)的BT细胞悬浮培养工艺以提高CSFV抗原含量,采用2 L生物反应器对BT细胞的最佳接种密度、CSFV的最佳接种剂量进行了摸索和优化,采用优化的工艺参数,进行了BT细胞5倍消化放大工艺验证,同时对比了BT细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺增殖CSFV的差异。结果表明,在3 g/L微载体浓度下,采用1.5×10~5个/mg的细胞初始接种密度,培养72 h可获得最佳细胞密度;采用MOI(感染复数)为0.5的接种剂量可收获≥106.8FAID_(50)/mL的CSFV抗原;BT细胞从2 L到10 L生物反应器的5倍消化放大工艺验证试验,3批细胞培养96 h均能达到4.0×10~6个/mL以上;悬浮培养工艺增殖的CSFV抗原含量约是转瓶培养工艺的15倍。以上试验为猪瘟疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

紫云英嫩梢矿质元素成分及作为菜用营养价值的分析

为探明不同紫云英(Astragalus sinicus L.)品种嫩梢矿质元素含量的差异,分析其菜用营养价值,本研究测定了10个不同紫云英品种的分枝期地上部嫩梢的8种矿质元素含量,同时,结合主成分分析法与系统聚类法筛选了适宜菜用的品种。结果表明紫云英嫩梢中矿质元素含量由高到低为钙(Ca)>磷(P)>镁(Mg)>铁(Fe)>锰(Mn)>锌(Zn)>铜(Cu)>硒(Se);矿质元素含量综合得分排名前3的品种分别为‘湘紫1号’、‘闽紫7号’和‘弋江籽’;将10个紫云英品种聚为四类(A,B,C,D),其中A,B,C类分别以高Ca, Fe及Cu含量为特征,D类为‘湘紫1号’,其矿质元素含量均较高,综合评价最高。因此,紫云英种质间嫩梢矿质元素含量均有不同程度的差异,‘湘紫1号’嫩梢矿质元素含量高,作为菜用综合品质高。     

Coxiella burnetii associated reproductive disorders in domestic animals-a critical review

The bacterium Coxiella burnetii has been detected in the fetal membranes, birth fluids and vaginal mucus, as well as in the milk and other excretions of several domestic mammals. The finding of C. burnetii in association with abortion, parturition and in the postpartum period has led to the hypothesis that C. burnetii causes a range of reproductive diseases. This review critically evaluates the scientific basis for this hypothesis in domestic mammals.The review demonstrates a solid evidence for the association between C. burnetii infection and sporadic cases of abortion, premature delivery, stillbirth and weak offspring in cattle, sheep and goats. C. burnetii induced in-herd epidemics of this complete expression of reproductive failure have been reported for sheep and goats, but not for cattle. The single entities occur only as part of the complex and not as single events such as generally increased stillbirth rate. Studies show that C. burnetii initially infects the placenta and that subsequent spread to the fetus may occur either haematogenous or by the amniotic-oral route. The consequences for the equine, porcine, canine and feline conceptus remains to the elucidated but that infection of the conceptus may occur is documented for most species. There is no solid evidence to support a hypothesis of C. burnetii causing disorders such as subfertility, endometritis/metritis, or retained fetal membranes in any kind of domestic animal species.There is a strong need to validate non-pathology based methods such as polymerase chain reaction for their use in diagnostic and research in relation to establishing C. burnetii as the cause of abortion and to adapt an appropriate study design and include adequate control animals when linking epidemiological findings to C. burnetii or when evaluating effects of vaccination in production herds.     

Epidemiological and genetical studies in Norwegian pig herds. III. Herd effects

Herd differences in disease incidence in 70 Norwegian pig herds were assessed by health card registrations. Such differences proved to be considerable. The incidence of the MMA-syndrome, mastitis, metritis and neonatal diarrhoea was higher in herds producing only weaners ("weaner herds") than in herds with combined production. The mean disease incidence in herds providing breeding stock for the Norwegian Pig Breeders' Association ("breeding herds") was at the same level as in ordinary combined production herds. There was no consistent relationship between changes in disease incidence and herd size, though the incidence of the MMA-syndrome was lower in the largest herds.     

不同密度甘肃马先蒿寄生和内生真菌互作对紫花针茅内源激素及生物碱含量的影响

根寄生植物是禾草生长过程中的一种生物逆境,禾草内生真菌能增强其对生物或非生物逆境的耐受能力;然而,有关禾草内生真菌对不同密度根寄生逆境下禾草生长、内源激素水平和生物碱含量变化的研究鲜有报道。基于此,通过开展温室盆栽试验,以建立根寄生关系的带菌(E+)和未带菌(E-)紫花针茅及根寄生植物-甘肃马先蒿为研究对象,比较E+和E-紫花针茅在不同甘肃马先蒿寄生强度下生长、内源激素和生物碱含量变化。结果表明,与未寄生紫花针茅相比,随着甘肃马先蒿密度增加,紫花针茅生物量降低80%,株高、分蘖数和根长均降低25%,吲哚乙酸、脱落酸含量分别增加43%和51%,细胞分裂素含量降低50%。内生真菌侵染显著提高紫花针茅生长特性,增加内源激素和生物碱含量;带菌紫花针茅在根寄生逆境下生物碱含量持续增加,同时甘肃马先蒿利用根部木质部通道可获取寄主内生真菌合成的生物碱。由此可见,内生真菌通过调控紫花针茅体内有关生长和逆境预警相关内源激素水平及改变生物碱含量的方式增强紫花针茅对甘肃马先蒿根寄生逆境的耐受能力,为利用禾草内生真菌共生体修复甘肃马先蒿型退化草地提供新视角。     

Surveys on Coxiella burnetii infections in Swedish cattle,sheep, goats and moose

Background

Q fever is a zoonotic disease caused by the bacterium Coxiella burnetii. Prevalence data in ruminant species are important to support risk assessments regarding public and animal health. The aim was to investigate the presence of or exposure to C. burnetii in cattle, sheep, goats and moose, and to compare two enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). National surveys of antibodies against C. burnetii were performed for dairy cattle (n=1537), dairy goats (n=58) and sheep (n=518). Bovine samples consisted of bulk milk, caprine of pooled milk, and ovine of pooled serum. Antibodies were investigated in moose samples (n=99) from three regions. A one-year regional cattle bulk milk survey was performed on the Isle of Gotland (n=119, four occasions). Cattle, sheep and goat samples were analysed with indirect ELISA and moose samples with complement fixation test. For the sheep, goat, and parts of the cattle survey, samples were run in parallel by ELISAs based on antigens from infected ruminants and ticks. Bulk milk samples from the regional cattle survey and vaginal swabs from a subset of the sheep herds (n=80) were analysed for the agent by polymerase chain reaction. Spatial clustering was investigated in the national cattle survey.

Results

The prevalence of antibodies in dairy herds was 8.2% with large regional differences. High risk clusters were identified in the southern regions. The prevalence among dairy herds on the Isle of Gotland varied from 55.9% to 64.6% and 46.4% to 58.9.0% for antibodies and agent, respectively, overall agreement between agent and antibodies was 85.2%. The prevalence of antibodies in sheep was 0.6%, the agent was not detected the vaginal swabs. Antibodies were not detected in goats or moose, although parts of the moose samples were collected in an area with high prevalence in cattle. The overall agreement between the two ELISAs was 90.4%.

Conclusions

The prevalence of antibodies against C. burnetii in dairy cattle in Sweden shows large regional differences. The results suggest that C. burnetii is a rare pathogen among Swedish moose, dairy goat and sheep. ELISAs based on ruminant and tick antigen performed in a similar manner under Swedish conditions.     

高寒草甸优势禾草-异针茅内生真菌的分离与鉴定

异针茅作为青藏高原地区重要的乡土草种之一,是高寒草甸草原主要的建群禾草种类。迄今为止,有关异针茅所感染内生真菌的种类和分类地位的研究尚未见报道。基于此,以青海高原地区两个地理种群的异针茅为研究对象,采用常规分离培养形态观测和管家基因扩增目的片段基因并与已公布的内生真菌序列构建系统发育树的方法,确定异针茅感染内生真菌的种类和分类地位。结果表明:异针茅分离出的内生真菌菌落形态、生长速度和分生孢子形态等均与Epichloё属内生真菌的形态特征相似。编码蛋白tub和肌动蛋白actin序列构建的系统发育树表明,异针茅感染的内生真菌种类分别为Epichloёgansuensis和Epichloёsylvatica,而转录延长因子tef序列构建的系统发育树发现异针茅感染的内生真菌种类分别为Epichloёinebrians和E.sylvatica。由此可见,异针茅感染的内生真菌分别为甘肃内生真菌E.gansuensis、醉马草内生真菌E.inebrians和欧洲短柄草内生真菌E.sylvatica;进一步揭示异针茅感染的内生真菌表现出多样性,异针茅与其感染的内生真菌间未形成严格的宿主特异性。     

11种牛分枝杆菌抗原在牛结核病诊断中的初步评价

为筛选及评价用于牛结核病诊断的抗原,本试验将CFP-10、ESAT-6、TB10.4、TB27.4、MPT51、MPT63、MPT64、MPB70、MPB83、Rv3872和Ag85B共11种牛分枝杆菌抗原分别作为包被抗原建立间接ELISA方法,比较其对牛结核病的检出率;同时利用豚鼠和牛的皮试试验评价重组蛋白作为皮试试验刺激原的潜力。此外,将重组蛋白分别刺激结核病阳性牛和阴性牛的抗凝血24 h,检测血浆中的IFN-γ水平,评价各重组蛋白作为IFN-γ释放试验刺激原的潜力。结果显示,不同重组蛋白对结核病阳性血清的反应活性不一,MPB70总检出率最高,为59.7%;其次是Ag85B、ESAT-6和MPB83,检出率均在45%以上;MPT51的检出率最低,仅为2.2%。豚鼠和牛皮试试验均显示,单个重组蛋白作为刺激原难以产生令人满意的迟发型过敏反应（delayed type hypersensitivity,DTH）,而TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63或Rv3872作为补充抗原,分别与CFP-10或ESAT-6混合,均可特异性地刺激结核病阳性牛产生较强的DTH反应,且与PPD-B无显著差异（P>0.05）。重组蛋白CFP-10、ESAT-6、TB10.4和MPT51均能刺激结核病牛全血释放一定的IFN-γ,其中CFP-10、CFP-10-ESAT-6串联蛋白和MPT51刺激结核病阳性牛全血释放的IFN-γ显著高于阴性牛（P<0.05）。因此,这11种牛分枝杆菌抗原并不适合单独用于牛结核病的血清学诊断、皮试试验或IFN-γ释放试验,但以CFP-10和ESAT-6为核心,TB10.4、TB27.4、MPT64、MPT63、Rv3872或MPT51作为其补充抗原,均能提高检测敏感性,有作为皮试试验和IFN-γ释放试验特异性刺激原用于牛结核病诊断的潜力。     

硒缺乏通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导鸡胸腺细胞凋亡

本试验旨在探讨硒缺乏是否通过激活Toll样受体信号通路诱导鸡胸腺细胞凋亡。复制硒缺乏模型,将200只1日龄健康的肉鸡随机分为对照组（C组）和缺硒组（L组）,对照组饲喂硒含量0.2 mg·kg^-1的正常日粮,缺硒组饲喂硒含量0.004 mg·kg^-1的缺硒日粮。在15、25、35、45、55日龄时,每组分别选取15只鸡,观察胸腺组织病理形态变化和超微结构变化;检测胸腺组织中TLR4信号转导通路与细胞凋亡相关因子的表达。又建立了MDCC-MSB1（MSB1）细胞硒缺乏模型,并在此基础上设立6个分组：对照（C group）组、缺硒（L group）组、缺硒+转染空质粒（L+pCMV-HA-N）组、缺硒+siRNA阴性对照（L+NCsiRNA）组和缺硒+过表达TLR4（L+pCMV-HA-TLR4）组、缺硒+干扰TLR4（L+siChTLR4）组,低硒处理5 d后,检测细胞活力、细胞凋亡情况、TLR4信号转导通路与细胞凋亡相关因子的表达。结果显示：1）与C组相比,L组皮质髓质的淋巴细胞数量减少、细胞排列紊乱、皮质髓质充血、核碎裂,广泛的局灶性坏死。L组鸡胸腺组织淋巴细胞间出现裂隙,体积缩小,细胞碎裂,核染色质边集,线粒体肿胀,嵴断裂。2）与15日龄C组相比,L组鸡胸腺中TLR4、MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白表达水平在15~55日龄中均显著上调,Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平呈相反趋势。3）与C组相比,L组MSB1细胞活力显著下降、细胞凋亡数量明显增加、TLR4、MyD88、NF-κB、Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白的表达均显著增加、Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平极显著降低;与L组相比,L+siChTLR4组细胞活力明显增强、细胞凋亡数量明显减少、相关因子mRNA和蛋白表达显著下降,而L+pCMV-HA-TLR4组细胞活力明显降低、细胞凋亡数量明显增加、相关因子mRNA和蛋白表达均明显增加。综上所述,硒缺乏通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导鸡胸腺细胞凋亡,并进一步诱导鸡胸腺损伤。     

细胞因子IL-17作为牛结核病诊断标志物的研究及实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在评价细胞因子IL-6和IL-17 mRNA转录水平与牛分枝杆菌感染之间的关系,及其在牛结核病诊断中的应用潜力。通过皮内变态反应试验和IFN-γ释放试验临床筛选结核病阳性牛和结核病阴性牛,采集试验动物抗凝全血,分离、收集外周血淋巴细胞,分别用牛结核菌素（PPD-B）、禽结核菌素（PPD-A）、重组蛋白CFP-10-ESAT-6（CE）、pET-32a载体标签蛋白（PET）或PBS 37℃培养6 h,用实时荧光定量PCR检测细胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的mRNA相对转录水平。结果显示,PET和空白对照PBS类似,不能刺激细胞因子mRNA转录水平的提高,表明CE中包含的PET对试验的影响可忽略不计;牛外周血淋巴细胞经PPD-B、PPD-A或CE刺激后,结核病阳性牛样品中IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平均显著高于结核病阴性牛（P<0.05）,其中PPD-B刺激效果强于CE和PPD-A,而CE刺激的特异性更好;选取CE作为最佳刺激源,结果显示,IL-17和IFN-γ的mRNA转录水平之间相关性良好（spearman r=0.79）,并初步建立了基于IL-17和IFN-γ转录水平的实时荧光定量PCR检测方法;以此方法对14头结核病阳性牛进行临床检验,IL-17实时荧光定量PCR法的阳性样本检出率为85.7%,高于IFN-γ（71.4%）。本研究结果初步表明,牛分枝杆菌特异性抗原（PPD-B、CE）诱导的IL-17 mRNA转录水平与牛结核病相关,以CE为刺激源建立的IL-17实时荧光定量PCR检测方法具有用于牛结核病诊断的潜力。     

氟苯尼考-羟丙基-β-环糊精包合物的研制

为了提高氟苯尼考在水中的溶解度,探讨氟苯尼考包合物批量生产工艺,采用胶体磨和喷雾干燥技术制备氟苯尼考-羟丙基-β-环糊精包合物,并用正交试验法优化工艺参数,以包合率和得率为判断指标,得到包合物的最佳条件为氟苯尼考与羟丙基-β-环糊精摩尔投料比是1∶1,包合时间为1 h,氟苯尼考在整个溶液体系中的药物浓度为6 mg/mL。所得包合物经红外光谱法、差示扫描量热分析法进行分析鉴定,表明氟苯尼考与羟丙基-β-环糊精形成了包合物,其包合率可达到83.74%,得率达98.48%,氟苯尼考溶解度由原来的1.25 mg/mL提高到了40.76 mg/mL。表明该工艺能够用于氟苯尼考-羟丙基-β-环糊精包合物的批量制备。