葛根SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

[目的]优化葛根SCoT-PCR反应体系,筛选适用于葛根的SCoT引物,为利用SCoT分子标记进行葛根种质资源鉴定、遗传多样性分析及分子标记辅助育种提供技术支持.[方法]采用正交设计对SCoT-PCR反应体系中的DNA模板量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶量和引物浓度5个因素进行优化,利用最佳SCoT-PCR反应体系筛选出适用于葛根的SCoT引物,并对该体系进行验证.[结果]最佳葛根SCoT-PCR反应体系20.00μL:DNA模板50.00ng,dNTPs 0.25mmol/L,Mg2+1.50mmol/L,引物0.80μmol/L,TaqDNA聚合酶0.50U.利用该体系从36条SCoT引物中筛选出35条可从葛根中扩增出清晰条带的引物.使用3条引物对18个葛根材料进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的重复性、稳定性和丰富的多态性.[结论]建立的最佳葛根SCoT-PCR反应体系和筛选获得的35条SCoT引物可适用于葛根种质资种鉴定、遗传多样性分析、相关分子标记开发等研究.     

制干辣椒SCoT-PCR体系优化及引物筛选

[目的]优化制干辣椒SCoT-PCR反应体系,为新疆制干辣椒种质资源、分子遗传学研究奠定基础.[方法]以制干辣椒为材料,采用L25(55)正交设计方法对影响制干辣椒SCoT-PCR反应体系的Mg2+、模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTPs等因素进行优化筛选.[结果]从25个正交设计组合中筛选获得5个组合的扩增效果较好,扩增条带丰富且清晰度适中、分散性好;经引物SC-12、SC-13、SC-19筛选,获得适用于制干辣椒材料的SCoT-PCR最佳反应体系20.0 μL,包含10×Buffer 2.0 μL、30 ng模板DNA 0.8 μL、2.0 mmol/L Mg2+ 1.8μL、1.0 μmol/L引物1.0 μL、1 U Taq DNA聚合酶0.4μL、0.25 mmol/L dNTPs 0.5 μL、ddH2O 13.5 μL.运用优化体系从80条引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SCoT引物24条.[结论]优化的SCoT-PCR反应体系及筛选的引物可用于新疆制干辣椒种质鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性的分析等.     

甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选

以甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)交配型菌株基因组DNA为模板,在单因素优化试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计,对影响甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、r Taq DNA聚合酶和模板用量5个因素进行优化,建立优化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系:DNA模板12.50ng、dNTPs 0.17mmol/L、引物0.46μmol/L、Mg2+1.7 mmol/L、r Taq DNA聚合酶0.85U、1×Buffer(Mg2+free),总体积25μL。应用优化体系从30条SCoT引物中筛选扩增条带清晰且多态性丰富的10条引物,并利用这10条引物对10份地理来源和寄主来源不同的甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组DNA进行SCoT标记,结果共扩增出86条带,多态性比率为58.67%,平均每条引物扩增8.60条。UPGMA聚类分析结果表明:在遗传相似系数为0.75的水平上,可将10个菌株分为3类,聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。     

芥菜SCoT分析体系的建立与优化

采用L25(56)正交设计方法,对影响芥菜SCoT-PCR反应的Mg2-,dNTPs,Taq酶,引物,模板DNA等因素的浓度进行优化,建立了适用于芥菜研究的SCoT PCR最佳反应体系:20μL反应体系中,含有Mg2+1.875 mmol/L,dNTPs 0.35 mmol/L,Taq酶2.00 U,Primer 0.875 μmol/L,模板DNA 10 ng.利用芥菜的16个品种对该反应体系进行验证,得到了条带清晰、亮度适中、稳定可靠的电泳图.     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

SCoT分子标记在沙糖橘遗传多样性分析中的应用

[目的]优化适合柑橘的SCoT反应体系,并利用优化的SCoT体系分析无籽沙糖橘和有籽沙糖橘的遗传多样性.[方法]采用正交设计方法分别对反应体系中DNA模板、Mg2+、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶的浓度等进行优化.利用优化的体系,选用60条SCoT引物对有籽沙糖橘和无籽沙糖橘进行扩增,扩增出有差异条带进行SCAR转化.[结果]优化的柑橘ScoT反应体系为:Mg2+ 1.5 mmol/L,dNTPs0.35 mmol/L,引物0.25 μmol/L,Taq酶0.5 U,模板DNA 30 ng,总反应体系为20μl.最适退火温度为50.6℃.利用优化的体系,选用60条SCoT引物对有籽沙糖橘和无籽沙糖橘进行分析,经过引物筛选,获得了较好扩增的SCoT引物共42条,通过42条SCoT引物对有籽沙糖橘和无籽沙糖橘的筛选,获得了1条有差异条带引物.[结论]有籽沙糖橘和无籽沙糖橘基因组水平上存在差异.     

早熟马铃薯 ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为得出马铃薯ISSR-PCR最佳的反应体系,采用正交试验设计,对rTaq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs和引物进行5因素4水平筛选.结果表明,马铃薯ISSR-PCR的最佳反应体系为:总体积25 μL的反应体系中含有rTaq DNA聚合酶0.5 U、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、模板DNA用量为75 ng、dNTPs浓度为200 μmol/L、引物浓度为0.8 μmol/L.这些因素对PCR反应的影响大小顺序为Mg2+浓度＞rTaq DNA聚合酶用量＞dNTPs浓度=引物浓度＞模板DNA用量.应用该最佳反应体系对39条ISSR引物进行筛选,得出15条条带清晰、条带数多、重复性好的引物.并通过退火温度梯度试验得出筛选引物的最佳退火温度.     

蝴蝶兰RAPD反应体系的建立

为建立一个稳定的蝴蝶兰RAPD反应体系,对RAPD反应体系中模板DNA、Taq DNA聚合酶用量、随机引物浓度、Mg2+浓度和dNTPs浓度等各项参数进行筛选比较。结果表明,最佳反应体系为:25μl反应体系中,其中含模板DNA(20 ng/μl)1.5μl,Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.4μl,随机引物(20μmol/L)1μl,Mg2+(25 mmol/L)2.5μl,dNTPs(10 mmol/L)0.5μl,10×PCR Buffer2.5μl,ddH2O 16μl。     

大白菜InDel-PCR反应体系的优化

采用CTAB法提取大白菜基因组DNA,利用单因素试验对InDel-PCR反应体系中的dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、模板DNA用量、引物浓度、退火温度、三温循环时间等7个因素进行筛选和优化。结果表明,适用于大白菜InDel-PCR分析的最佳扩增条件为(20μL):dNTPs 0.1mmol/L、Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.4U、模板DNA 105ng、引物浓度0.4μmol/L、退火温度50℃、三温循环时间30s-30s-45s。该体系可用于大白菜遗传多样性分析及遗传图谱构建。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

利用正交设计优化芦笋SRAP反应体系

以芦笋（Asparagus offinalis L．）为材料,对影响SRAP—PCR扩增结果的因素dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2＋、引物、模板DNA进行了正交优化设计的研究。结果表明,适合芦笋SRAP—vcR析的最佳反应体系：20μL的反应体积中包括0．2mmol／LdNTPs0．4gL;1UTaqDNA酶1．0gL;1．5mmol／LMg2 1．2μg;上下引物各30ng,每个引物O．5此;60ng模板DNA1．1.0μL;10Buffer2．0凼无菌双蒸水13．4此。为今后利用SRAP标记技术研究芦笋的遗传多样性奠定基础。     

高原鼠兔ISSR引物反应体系的优化与筛选

[目的]筛选和优化高原鼠兔(Ochotona curzoniae)适宜的ISSR反应体系,以在对高原鼠兔进行ISSR分析时获得清晰和多态性好的扩增结果。[方法]以高原鼠兔基因组DNA为模板,通过单因素试验,对体系中的模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物用量、退火温度进行探讨。[结果]结果表明,高原鼠兔ISSR-PCR扩增的最佳条件为:25μl PCR反应体系,其中4lμDNA模板,1.5 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1.25 UTaq聚合酶,1.5μmol/L引物,复性温度4560℃(退火温度随引物不同而确定)。用11条引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的6条引物。[结论]该反应体系的建立为鼠兔遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

辣椒SRAP-PCR反应体系优化及杂交群体多态性引物筛选

[目的]对辣椒SRAP反应体系进行研究和优化,并利用优化体系对164对多态性引物进行筛选。[方法]采用单因素随机试验设计和L25(65)正交试验设计对辣椒SRAP反应体系中6种关键因素(退火温度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行体系优化,并以"泡椒"×"青皮大椒"的亲本和F1代为材料,利用聚丙烯胺酰胺凝胶进行筛选。[结果]辣椒SRAP-PCR的最佳反应体系为:退火温度35.5℃,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 2.25 ng/μl,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.4μmoL/L,Mg2+2 mmol/L,总体积为20μl。利用该体系,从164对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、条带稳定的31对引物组合。[结论]该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒育种中的应用奠定了基础。     

正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系

以莲雾品种‘农科一号’为试材,采用经改良的CTAB法提取莲雾叶片的DNA,探讨了Mg2+、dNTPs、引物浓度、Taq聚合酶、模板DNA含量对莲雾ISSR-PCR的影响。建立了总体积为25μL的莲雾ISSR-PCR反应体系:Mg2+浓度为3.0mmol.L-1﹑dNTP浓度为0.2mmol.L-1﹑primer浓度为0.4μmol.L-1﹑Taq DNA聚合酶1.5U﹑模板DNA含量为30ng,并含2.0μL 10×PCR Buffer(Mg2+free)。应用该反应体系对‘农科一号’和‘农科二号’进行ISSR-PCR扩增,共筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（4^5）对小麦SRAP．PCR反应体系中的5因素（细聚合酶、Mg^2、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系的影响为：Mg^2〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP—PCR体系为：在20山反应体系中,包括10×PCRBuffer2．0山、Mg^2 2．0mmol／L、砌聚合酶2．0U、dNTPs0．2mmol／L、模板DNA40ng、引物0．6μmolVL。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

珍稀濒危植物银缕梅ISSR-PCR反应体系建立及优化

[目的]建立和优化银缕梅ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验和单因子试验对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶用量5个因子进行分析研究。[结果]银缕梅ISSR-PCR 25μL反应体系中5个因子最优水平:DNA模板(20 ng/μL)2.50μL,引物(10μmol/L)1.00μL,Taq酶(5 U/μL)0.10μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)3.00μL,d NTPs(2.5 mmol/L)1.50μL。[结论]银缕梅ISSR-PCR反应最优体系的建立为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子指纹图谱构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。