柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析

通过PCR扩增6个不同地区柑橘黄龙病(citrus huanglongbing,HLB)病原菌的核糖体蛋白基因,采用4种不同的限制性内切酶对PCR产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析;并对核糖体蛋白基因克隆和测序后,使用DNAman和NCBI Blast等软件对基因序列进行比对分析,并通过软件Mega4.1构建其系统发育树.结果表明:6个分离物核糖体蛋白基因的RFLP指纹图谱有所差异,表现出一定的多态性;不同分离物核糖体蛋白基因的核酸序列和氨基酸序列均存在差异,但相互之间同源性很高,其中核酸序列与数据库中亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)的同源性高达99%～100%,与非洲种(Ca.L.africanus)的同源性为85%,与美洲种(Ca.L.americanus)的同源性为77%～80%;系统发育分析显示所有的Ca.L.asiaticus亲缘关系极近,归为一个类群,而后与Ca.L.africanus和Ca.L.americanus组成韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter)一个大的类群.     

柑桔黄龙病菌亚洲种菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表达及抗血清制备

柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein, 408)是一种丰度较高的分泌蛋白。以感染柑桔黄龙病(HLB)的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408基因的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段。序列分析结果表明海南琼海黄龙病菌408基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62株系 (GenBank登录号:CP001677.5)408基因序列一致。功能预测结果表明其含有一个与菌毛形成相关的N端结构域,以及C端含有两个高度保守的基序(Motif 1和Motif 2)。通过Eco R Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切构建重组载体p ET32a-408并将其转化BL21(DE3)大肠杆菌。重组菌经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化,并以此为抗原,腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶10000的多克隆抗血清;Western blot进一步分析表明,408蛋白多克隆抗血清特异性强。研究结果为柑桔黄龙病菌408蛋白功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要科学依据。     

柑橘衰退病毒柚类分离物CP基因的克隆及原核表达分析

以来自湖北省的HB柚柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)分离物(CTV-HB1)为材料,利用RT-PCR技术对其CP基因进行克隆,序列分析结果表明:CTV-HB1与典型茎陷点分离物SY568和NUagA的核苷酸和推定氨基酸的序列相似性均在97%以上,而与CTV速衰分离物T36和弱毒分离物T385和T30的核苷酸和氨基酸序列相似性较低,均在95%以下。将CP基因片段连接到表达载体,转化大肠杆菌后诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE和Westen-blot分析结果表明,经IPTG诱导后产生了预期大小的重组蛋白,该蛋白可与CTV-L5提纯病毒制备的多克隆抗体发生特异性免疫反应。     

湖南省柑橘黄龙病菌的PCR检测及序列分析

从湖南省8个市(县)采集柑橘黄龙病疑似植株的叶片,以特异引物进行PCR检测。结果表明:8个市(县)所采样品均检测到了柑橘黄龙病病原菌,其中新宁、武冈、隆回、洞口和通道县为首次发现,各地病原菌序列与柑橘黄龙病亚洲种(M94319)的同源性高达99.1%～100%;不同地区的柑橘黄龙病病原菌存在微小差异,其中新宁与通道县病株差异稍大。这说明由特异性引物建立的PCR检测技术具有特异性强、准确率高、可重复性好等特点,可用于柑橘黄龙病的快速检测。     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。     

柑橘黄龙病菌侵染对甜橙叶片糖代谢的影响

【目的】研究甜橙（Citrus sinensis）在柑橘黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）侵染下不同时期糖代谢的变化,以探讨其与柑橘叶片中淀粉积累间的关系,为进一步阐明柑橘黄龙病的发病机理提供理论依据。【方法】以甜橙为供试材料,采用腹接接种病原的方法,试验组植株用感染黄龙病菌的芽条进行嫁接,对照组植株用健康芽条进行接种,每个植株均嫁接3个芽条。在检测到感病的植株中选取生长状况良好且接近的3株作为后续试验材料,每月采集1次成熟叶片,至10月份结束。采集的叶片立即抽提DNA和RNA,并进行可溶性糖及淀粉含量的测定,其余叶片用液氮速冻后保存于-80℃用于测定糖代谢过程中关键酶活性的变化,同时利用实时荧光定量PCR技术比较二者关键酶基因表达量的差异。【结果】随着病原菌胁迫时间的延长,可溶性糖和淀粉含量总体呈升高趋势,均在6月达到峰值,分别为对照的1.59和3.73倍,在感病后期开始有所下降;通过对二者的比值分析发现,感病植株的比值随时间的延长不断下降。在黄龙病菌侵染的不同阶段,各种酶的作用程度有所不同。感病植株的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性在感病初期迅速上升至顶峰,高达58.44 μg·g^-1·min^-1,至后期已略微低于对照;酸性转化酶（AI）总体显示出较高活性,各个时期均有显著性差异（P＜0.05）,感病中期活性最高为对照的2.91倍;中性转化酶（NI）活性在感病和对照中均维持较低水平,且变化趋势基本一致;可溶性淀粉合成酶（SSs）与束缚性淀粉合成酶（GBSS）协调作用,共同参与淀粉合成的调控;淀粉酶活性在感病不同时期均有所下降,在感病中期低至0.38 U·g^-1。定量PCR分析表明,蔗糖磷酸合成酶基因SPS1表达量显著升高,与其酶活性具有显著相关性（P＜0.05）。蔗糖分解相关基因中,蔗糖合成酶基因SuSy在感病不同时期的表达差异不大,变化幅度小;细胞壁酸性转化酶基因CSCWI在不同时期均上调表达,最高上调约7.4倍,且表达量一直维持在较高水平;与CSCWI相比,液泡酸性转化酶基因CUAI1的表达水平较低。淀粉合成相关酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因最高上调3倍左右;淀粉分解相关基因BAM3、MEX1和DPE2在不同时期有所下调,达到显著性差异水平（P＜0.05）。【结论】柑橘黄龙病感染甜橙后,对植株叶片中光合产物的形成与运转产生影响,扰乱宿主糖代谢平衡,与宿主淀粉积累及后期症状的产生有密切关系。     

柑橘黄龙病菌分泌蛋白的预测和原核表达

柑橘黄龙病是我国柑橘产业可持续发展面临的重大威胁,建立高效、准确、灵敏的检测方法是黄龙病防控的关键.通过生物信息学分析柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)不同菌株基因组,预测出83个经典分泌蛋白和87个非经典分泌蛋白.选定其中14个分泌蛋白基因,经大肠杆菌密码子优化后构建pET-28a-CLasSec和pCold-I-CLasSec系列原核表达载体.经IPTG诱导条件优化、镍磁珠法纯化后,获得了CLasSec2、CLasSec4、CLasSec5、CLasSec6、CLasSec8和CLasSec12等6个柑橘黄龙病菌亚洲种分泌蛋白.     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

杜仲EuGT4基因原核表达及其编码蛋白纯化

为进一步研究杜仲糖基转移酶结构和功能提供科学依据,利用贵州省农业生物工程重点实验室构建的杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)基因组数据库注释信息,从杜仲克隆得到1个全长为1 461bp的糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)cDNA序列,将该基因命名为EuGT4;利用基因重组技术构建原核表达载体pET30a-EuGT4,遗传转化大肠杆菌BL21(DE3);在37℃条件下,以终浓度为0.2mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导16h,并采用镍-亚氨基二乙酸(Ni-IDA)亲和层析柱纯化蛋白,以15%SDSPAGE凝胶电泳定性分析。结果表明:EuGT4重组蛋白以包涵体形式在BL21(DE3)中表达,经SDS-PAGE凝胶电泳检测和Western Blot鉴定,在相对分子质量约50kD处有1条特异性蛋白条带,确定为杜仲EuGT4蛋白。     

PTD-FNK蛋白的原核表达及纯化鉴定

【目的】原核表达Bcl-xL蛋白的突变体PTD-FNK蛋白,为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物,以pET-28a(+)-PTD-Bcl-xL质粒为模板,PCR扩增两段突变序列;回收PCR产物片段进行Dpn I消化,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导融合蛋白表达,探索IPTG诱导表达的适宜温度,最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp,经Dpn I消化后进行重组反应,再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建pET-28a(+)-PTD-FNK质粒。在30℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白,以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白,且诱导时间短,无须复性,有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。     

水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

贵州黑山羊MSTN基因原核表达条件优化及蛋白纯化

为进一步研究MSTN重组蛋白的表达及相关功能奠定基础,利用RT-PCR克隆贵州黑山羊MSTN基因cDNA序列,构建原核表达载体pET-32a(+)-MSTN69,并对重组菌表达条件进行优化和Ni亲和层析纯化His-MSTN69蛋白。结果表明:表达产物与预期大小相符,His-MSTN69蛋白分子量为57.8 kD;在温度31℃和IPTG 0.8 mmol/L的条件下表达5h时,BL21-pET-32a(+)-MSTN69重组菌蛋白表达量最高。     

瓜实蝇普通气味结合蛋白基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE方法克隆获得瓜实蝇Bactrocera cucurbitae (Coquillett)普通气味结合蛋白(general odorant binding protein,GOBP)基因的cDNA全长序列,命名为BcucOBP.测序结果表明,BcucOBP开放阅读框全长447 bp,编码149个氨...     

蜡梅金属硫蛋白基因的克隆与原核表达

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒对其进行纯化回收,得到了高纯度蛋白,为今后研究奠定基础。     

维氏气单胞菌Cbl蛋白的原核表达及纯化

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)引起的细菌性疾病已威胁到鱼类养殖业的发展.Cbl(类CysB蛋白)是细菌硫代谢的重要调控因子之一.本研究选取pET-28a为Cbl的原核表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,使用IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,异丙基...     

柽柳转录因子基因ThbZIP1的原核表达及重组蛋白纯化

柽柳是重要的抗逆植物,提取柽柳总RNA,克隆了柽柳的16.5 k D b ZIP转录因子基因Thb ZIP1,构建原核表达载体p GEX-Thb ZIP1,导入宿主菌获得重组菌株BL21-Thb ZIP1,用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行重组蛋白r Thb ZIP1诱导表达。试验结果表明:IPTG浓度为1.0 mmol/L,诱导温度为37℃条件下,诱导4 h,大肠杆菌提取液提取50 min时,所获得重组蛋白r Thb ZIP1表达量最大,占总蛋白的76.42%;经过10%SDS-PAGE电泳检测,发现重组蛋白r Thb ZIP1主要以包涵体的形式存在;并利用电纯化法成功获得纯化的目的蛋白。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

柑橘木虱黄龙病菌携带量与其内生菌群相关性

【目的】分析柑橘木虱（Diaphorina citri）体内可能与黄龙病菌（Candidatus Liberibacter asiaticus）互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌（带菌）和不带菌黄龙病菌（不带菌）的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6-V8区,用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌：Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属（Bacillus,3株）、欧文氏菌属（Erwinia,1株）、克雷伯氏杆菌属（Klebsiella,1株）、葡萄球菌属（Staphylococcus,2株）、节杆菌属（Arthrobacter,1株）、泛菌属（Pantoea,2株）、果胶杆菌属（Pectobacterium,1株）、沙门氏菌属等（Salmonella,1株）、链霉菌属（Streptomyces,1株）、Massilia brevitalea（1株）等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11（嗜气芽孢杆菌属）在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位（头、胸、腹）内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 （Wolbachia sp.）、12（Wolbachia pipientis）、13（Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri）、14（Uncultured bacterium）、19（Serratia marcescens）、21和22（均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia）在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌（B. aerophilus）在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。