牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD.阳性质粒转化宿主菌BL21 (DE3),在IPTG诱导下获得高效表达.Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点.利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性.     

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）朊蛋白基因的克隆及其原核表达

采用RT-PCR技术从金黄地鼠(Mesocricetus auratus)脑组织获得朊蛋白基因(Prion protein nucleic acid,PRNP)开放阅读框(Open reading frame,ORF),截去其N端信号肽(66 bp)和C端GPI锚定位点(69 bp)形成朊蛋白编码区PRNPx;将编码区重组于融合表达质粒Pet-DsbA中,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,并经Western-blot验证。结果表明,金黄地鼠PRNP基因ORF区全长为765 bp,编码254个氨基酸的前体蛋白,核苷酸序列与已发表金黄地鼠序列(M14054)同源性为99.87%,其第116个氨基酸发生了同义突变由GCT变为GCC;朊蛋白在大肠杆菌得到高效表达,产物是相对分子质量为47 000的融合蛋白。     

重组牛朊蛋白特异性抗体的制备及鉴定

以原核表达后经纯化的重组牛朊蛋白为免疫原,免疫prnp-/-基因敲除鼠。4次免疫后,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。间接ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次克隆,用间接ELISA筛选出了稳定分泌针对牛重组朊蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为5C9D6。Western blotting鉴定结果表明,5C9D6均能特异性识别重组牛朊蛋白、健康牛、BALB/c脑组织匀浆中的PrPc,不识别prnp-/-基因敲除鼠脑组织匀浆液。本试验制备了可与牛、BALB/c鼠反应的单克隆抗体,同时也为牛海绵状脑病的研究及其诊断方法的建立奠定了基础。     

类朊蛋白Shadoo基因在Neuro-2α中的表达及细胞定位分析

为构建鼠类朊蛋白Shadoo基因重组真核表达质粒,并分析类朊蛋白Shadoo在鼠神经瘤细胞(Neuro-2α)内表达及定位.采用PCR方法把Flag标签序列插入到Shadoo阅读框122与123氨基酸住点之间,构建Shadoo-Flag融合基因片段,把Shadoo-Flag片段插入到真核表达质粒pcDNA3.1,构建重组真核表达pcDNA3.1-Shadoo-Flag,质粒酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转入Neuro-2α细胞,检测Shadoo基因表达及表达部位.结果重组真核表达质粒pcDNA3.1-Shadoo-Flag转入Neuro-2α细胞,能够正确表达出相对分子质量为12 000的Shadoo蛋白,并定位于细胞膜.     

金黄地鼠羊瘙痒病病理性朊蛋白标准物质的研制

选择25只羊痒病金黄地鼠标准毒株GSH263K临床末期的脑组织,经一系列离心洗涤纯化和蛋白酶K处理,获得高纯度的病理性朊蛋白。高纯度的病理性朊蛋白经80%甲酸灭活处理和真空离心干燥制备为待检标准物质,待检标准物质均匀性检验和稳定性检验其结果符合国家标准物质技术规范的要求。     

BAT3过表达提高内源朊蛋白的表达量

为了检测BAT3蛋白与朊蛋白的相互作用,探讨BAT3蛋白在朊蛋白合成和降解以及海绵状脑病发生过程中所起的作用。构建能够在细胞中表达全长朊蛋白的真核表达载体pGEFP-N1-PRNP和表达全长BAT3蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-HA-BAT3,应用脂质体方法分别将质粒转染进入Hela细胞,原代神经元,Neuro2a细胞。利用免疫荧光技术观察内源BAT3与全长朊蛋白的相互作用情况,利用免疫印迹技术检测BAT3过表达对内源朊蛋白表达的影响。结果在Hela细胞和原代神经元内,转染pGEFP-N1-PRNP后,自发绿色荧光蛋白的全长朊蛋白与内源BAT3发生共定位;Hela细胞和Neuro2a细胞转染pcDNA3.1-HA-BAT3后,随着外源全长BAT3表达量的增加,内源朊蛋白的表达量表现为剂量依赖性增加。表明BAT3能与朊蛋白发生相互作用,过表达BAT3能促进内源朊蛋白的表达,提示BAT3可能影响朊蛋白的合成。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

内蒙古地方品种绵羊朊蛋白基因多态性分析

对中国内蒙古的乌珠穆沁羊（46）、苏尼特羊（34）和蒙古羊（22）进行朊蛋白基因的克隆和多态性分析。结果表明,发现了8个朊蛋白基因多态性位点,其中M157I、Q220H、R223K为未见报道的朊蛋白基因多态性位点;痒病中度易感的朊蛋白基因ARQ/ARQ占74.5%,具有痒病抗性朊蛋白基因ARR/ARR占7.9%,未检出对痒病高度易感的朊蛋白基因VRQ/VRQ。从基因水平上推论,乌珠穆沁羊携带的羊痒病抗性的ARR/ARR基因频率较高（15.2%）,占ARR/ARR基因型的87.5%,发生羊痒病风险较低。该研究结果在中国活羊的出口贸易和品种选育方面有重要的意义,为出入境动物检疫中羊痒病的风险分析和风险评估提供重要的基础理论资料。     

酵母双杂交技术筛选朊蛋白PrP23-231互作蛋白

利用酵母双杂交技术,以pSos-PrP23-231载体为诱饵质粒,筛选小鼠脑cDNA文库中能与朊蛋白PrP23-231相互作用的蛋白。通过一次筛选,三次验证,从小鼠脑cDNA文库中得到2个阳性克隆,通过BLAST序列比对得到2个候选基因序列,并对验证后的阳性克隆的外源性片段进行测序及同源性分析,得到的蛋白编码基因可能与朊蛋白存在相互作用,其作用可能与疯牛病发病机制有关。     

实时荧光定量PCR检测PrP基因在金黄地鼠脑组织的动态表达

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,其脑组织内朊蛋白基因动态表达数据的测定对探讨该类疾病的发生、发展和分子致病机理具有重要意义。我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,对不同年龄金黄地鼠大脑、小脑、丘脑和脑干PrP基因的表达进行了定量。结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量,但是同一年龄段不同组织每纳克总RNA中朊蛋白基因的表达量和每毫克组织中朊蛋白基因的表达量有显著的差别,不同组织在不同年龄出现表达高峰。本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和脑组织在传染性海绵状脑病病理发生中的作用,提供了基础数据。     

PrP蛋白与Shadoo蛋白研究进展

朊蛋白(PrP蛋白)在传染性海绵状脑病中具有重要作用,但其生物学功能至今没有明确。Shadoo蛋白是一种与朊蛋白在N端结构上极为相似的新蛋白,SPRN是Shadoo蛋白的结构基因。由于Shadoo蛋白与PrP蛋白具有相同的生物学性质,且它们在脑组织中重叠表达,因此也被认为是研究朊蛋白的关键因素。文章主要探讨PrP蛋白与Shadoo蛋白在基因结构、蛋白功能、朊病毒感染方面的关系。     

人PrP多克隆抗体的制备及鉴定

制备PrP(prion protein)多克隆抗体,验证原核表达的人PrP的抗原性,为PrP空间构象的转变机制等深层次的研究以及人PrP单克隆抗体的制备提供重要的试验材料.以融合的人成熟PrP蛋白(mature prion protein,mPrP)为抗原,以pET30a(+)空载体的E.coli BL21 (DE3)的菌体蛋白作为对照免疫原,免疫小鼠.ELISA和Western blot分别检测多克隆抗体的效价和特异性.结果5只动物中3只均产生了较高效价的抗血清,确定人 PrP多克隆抗体效价为1∶4 096,能与人mPrP特异性结合.证明获得的人mPrP具有良好的免疫原性.     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

朊病毒检测方法综述

传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)是由朊病毒引起的人和多种哺乳动物以神经退行性变化为主要特征的一种慢性消耗性传染病,也称作朊病毒病;其是由体内正常细胞表面的PrP^C转变成PrP^Sc蛋白所导致。但PrP^Sc主要在脑内表达,在其他组织表达量很低,因此快捷准确的诊断方法对于该病有重要意义。作者重点介绍以朊病毒的致病特点为依据建立的检测方法,便于对该疾病的早期诊断、预防以及食品安全检测提供帮助,保障畜牧业的有序发展以及人类的健康。     

牛朊蛋白基因多态性对疯牛病影响的研究进展

朊蛋白(prion protein,PRNP)是近年来已证明的人和部分哺乳动物传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy,TSE)的主要根源,该蛋白编码基因的多态性显著影响了人和动物对TSE的易感性或抗病性。牛传染性海绵状脑病俗称"疯牛病"。作者分析了疯牛病的起源、监测和预防措施;简要介绍了牛PRNP基因的结构与功能;系统分析了牛科动物PRNP基因非编码区多态性与抗病性作用;总结了牛科动物PRNP基因启动子区域内23 bp插入/缺失和第1内含子区域内12 bp插入/缺失对疯牛病易感性的影响,为牛的抗病分子育种提供指导。     

梅花鹿朊蛋白核心片段的基因克隆与高效表达

本试验根据梅花鹿朊蛋白基因序列设计引物,利用PCR的方法从梅花鹿基因组DNA中扩增朊病毒蛋白酶抵抗区域PrP^res,将该片段分别与表达载体pET-Trx和pET-His连接,构建重组表达载体pET-Trx-PrP^res和pET-His-PrP^res。分别将两个重组表达载体转入E.coli BL21(DE3) plys宿主菌中,37 ℃诱导4 h,经SDS-PAGE分析,Trx-PrP^res和His-PrP^res表达量分别为38.2%和30.1%。     

杂交牛(大额牛×云南黄牛)朊蛋白基因 的分子克隆及其序列分析

朊蛋白(prion protein,PRNP)基因编码朊蛋白,是引起疯牛病的主效基因。本研究利用PCR方法首次从杂交牛(大额牛×云南黄牛)基因组中扩增了PRNP基因,GenBank登录号为HQ875337。PCR产物直接双向测序表明,该序列包含杂交牛PRNP基因795 bp的开放阅读框(ORF),编码264个氨基酸前体蛋白。生物信息学分析结果发现,该蛋白包含1个信号肽、3个α螺旋、2个β折叠、6个八肽重复序列、1个疏水区域、1个二硫键和1个糖基磷脂酰肌醇锚定位点。与已报道的其他牛PRNP基因进行序列比对分析,核苷酸和氨基酸的同源性均在97%以上。     

Hepatitis in dogs. An indexed bibliography of journal articles (1994–2004)

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are unique disorders that are not caused by infectious micro-organisms (bacteria or fungi), viruses or parasites, but rather seem to be the result of an infectious protein. TSEs are comprised of fatal neurodegenerative disorders affecting both human and animals. Prion diseases cause sponge-like degeneration of neuronal tissue and include (among others) Creutzfeldt–Jacob disease in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle and scrapie in sheep. TSEs are characterized by the formation and accumulation of transmissible (infectious) disease-associated protease-resistant prion protein (PrP^Sc), mainly in tissues of the central nervous system. The exact molecular processes behind the conversion of PrP^C into PrP^Sc are not clearly understood. Correlations between prion protein polymorphisms and disease have been found, however in what way these polymorphisms influence the conversion processes remains an enigma; is stabilization or destabilization of the prion protein the basis for a higher conversion propensity? Apart from the disease-associated polymorphisms of the prion protein, the molecular processes underlying conversion are not understood. There are some notions as to which regions of the prion protein are involved in refolding of PrP^C into PrP^Sc and where the most drastic structural changes take place. Direct interactions between PrP^C molecules and/or PrP^Sc are likely at the basis of conversion, however which specific amino acid domains are involved and to what extent these domains contribute to conversion resistance/sensitivity of the prion protein or the species barrier is still unknown.     

梅花鹿朊蛋白基因(PRNP)的克隆及序列分析

根据GenBank中鹿朊蛋白基因序列设计特异性扩增引物，采用PCR方法从中国梅花鹿基因组中扩增得到梅花鹿的朊蛋白基因，采用PCR产物直接测序，并将其克隆到pGEM—TEasy载体中测序进行进一步确认，通过分析表明所克隆的梅花鹿朊蛋白基因的ORF基因片段包含771bp，编码256个氨基酸的前体蛋白，相对分子质量约为28200。与已报道的其他品种鹿朊蛋白基因序列进行对比分析，核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98％以上。本试验为进一步研究中国梅花鹿朊蛋白的多态性提供了数据。