农杆菌介导Prd29A：DREB1A基因转化番茄的研究

DREB是植物体内一类特有的与逆境调节相关的转录因子.本试验以番茄材料06P28子叶外植体为受体,以prd29A:drEB1A嵌合基因为目的基因,利用根癌农杆菌介导的方法对番茄进行遗传转化,获得了4株抗潮霉索的抗性植株.对这些抗性植株进行GUS基因表达检测和PCR扩增检测,结果表明,其中的3株抗性植株中已经有稳定的GUS基因表达,并且PCR扩增也检测到目的基因Prd29A:DREB1A的存在.     

低酚棉胚性愈伤组织农杆菌转化体系建立及转DREB1C植株的获得

利用农杆菌介导法对低酚棉胚性愈伤组织转化转录因子DREB1C基因,探讨了低酚棉胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性和胚性愈伤组织状态对转化效率的影响。结果表明：胚性愈伤组织对潮霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为25mg／L,可明显抑制非转化组织生长。以继代培养7～14d的胚性愈伤组织作为转化受体,转化率高达56．3％。将转化后获得的抗性愈伤组织转入分化培养基中分化成苗,经过PCR检测得到5株阳性植株。     

农杆菌介导AFP1基因转化小麦获得转基因植株

以nptⅡ基因为筛选基因,利用农杆菌转化系统向普通小麦品种核生3号和99P的愈伤组织中转入白粉病抗性基因Rs-AFP1;获得抗生素抗性克隆数目分别为27个和24个,其中再生绿苗的克隆分别为2个和8个;PCR分析检测所得nptⅡ阳性植株分别为2株和6株,AFP1基因阳性植株分别为1株和4株。     

农杆菌介导rolC基因转化烟草植株的研究

通过根癌农杆菌介导手段，将来自发根农杆菌的rolC基因转化到烟草（Nicotiana tabacum)植株的基因组，并借助GUS组织化学法，PCR扩增法和Southen杂交进行了鉴定证实。 rolC基因改变转基因烟草植株某些性状的特点，如植株高变矮，花冠变小，雄蕊 变短等，还发现rolC基因具有延迟转基因烟草植株花期的作用。     

花生栽培品种转录因子基因DREB1的克隆及表达载体构建

本研究从33个花生栽培品种中克隆获得干旱胁迫响应转录因子基因PNDREB1,经序列分析发现,33个栽培品种PNDREB1的核苷酸序列同源性为100%,并构建了植物表达载体p GBDREB1,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

农杆菌介导的Bt cry1Ⅰa基因转化花椰菜的研究

利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry1Ⅰa基因构建了双T DNA边界的植物表达载体pCS1Ⅰa-LR,以瑞士雪球花椰菜具柄子叶和下胚轴为外植体,通过农杆菌介导法将cry1Ⅰa基因导入花椰菜中,共获得30株转化植株,经PCR检测,其中18株为PCR阳性植株,PCR阳性率为60%;RT-PCR和Western杂交检测结果表明,cry1Ⅰa基因在转基因花椰菜中可以正常转录和正确表达。转基因植株用小菜蛾幼虫进行饲虫试验,结果表明,转cry1Ⅰa基因花椰菜对小菜蛾具有很强的毒杀作用,昆虫幼虫的校正死亡率高达100%。获得的转基因花椰菜可用于下一步的抗虫花椰菜的培育。     

逆境相关转录因子DREB2A转化紫花苜蓿的研究

以逆境性相关转录因子DREB2A为目的基因、除草剂抗性的bar基因为标记,构建了植物表达载体pCD2A,并通过农杆菌介导法以无菌苗子叶为外植体转化公农1号苜蓿。经过共培养、抑菌和筛选培养,在含有2 mg/L Basta的培养基获得71株抗性再生植株。用1 mg/L的Basta对抗性植株叶片进行进一步筛选,并经PCR检测,获得11株阳性植株,表明DREB2A已整合到植株的基因组中。     

农杆菌介导的pac1基因转化大豆研究

选用高感大豆花叶病毒病而再生能力较强的大豆品种和品系作为受体,对丛生芽诱导培养基、侵染菌液的制备以及根的诱导方法进行了优化。采用优化后的遗传转化体系以农杆菌介导法将pac1导入大豆,MSB培养基中附加2 mg/L6-BA+0.2 mg/LIBA进行丛生芽诱导,液体YEB重悬活化菌体后侵染,MSB培养基中蔗糖含量15%+2 mg/LIBA+0.2 mg/L6-BA进行生根诱导。共获得8株PCR检测呈阳性植株,经SouthernBlot检测,证明pac1基因已整合到大豆基因组中。转基因植株对病毒的抗性评价正在进行中。     

农杆菌介导CBF1基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础。[方法]利用农杆菌介导CBF1基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时间对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响。[结果]以重组质粒pBI121-CBF1为模板,利用CBF1cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650bp的片段,表明重组质粒构建成功。在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡。用100μmol/LAS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高。农杆菌侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响。[结论]当AS浓度为100μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%。     

农杆菌介导大豆HS转录因子基因转化体系的建立

[目的]建立农杆菌介导的大豆HS转录因子基因转化体系。[方法]以携带耐盐耐旱转录因子HS基因的质粒HS/pCB302为表达载体,龙选1号大豆品种为试材,进行了除草剂浓度和外植体的筛选以及基因转化的预培养试验。[结果]以大豆茎段为外植体,在培养基中加入5 mg/L浓度的除草剂,在不进行预培养的条件下,获得最高的基因转化效率（22.3%）。[结论]该基因转化体系为培育耐盐抗旱大豆品种奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化

综述开展甘蔗基因工程育种工作20多年来,从最初的利用农杆菌介导法研究抗除草剂和抗虫转基因成功,到目前高转化效率的转基因方法应用过程中取得的成果,分析影响农杆菌转化甘蔗的关键因素,并对农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究前景作了展望.     

提高根癌农杆菌介导水稻遗传转化频率的研究

以15个籼、粳稻栽培品种作材料,研究了农杆菌转化水稻幼胚愈伤组织频率的一些影响因素。结果表明:NB培养基适用于各种基因型的水稻幼胚培养,愈伤组织与农杆菌共培养时间以3d为宜,而CCS培养基则适合于水稻转化愈伤组织的筛选培养。用羧苄青霉素抑制农杆菌效果优于头孢霉素,其适宜浓度为250～400mg/L,而潮霉素的筛选压以25～50mg/L较为合适。此研究通过优化各种转化因子,已从供试的15个品种中获得了14个品种的水稻转基因植株。     

抗逆相关基因GmDREB导入农杆菌的研究

利用改进的冻融法和电击法成功地将带有编码DREB转录因子GmDREB基因的prdGm-200双元载体分别导入根癌农杆菌EHA101、EHA105和LBA4404菌株中,同时探讨了影响冻融法和电击法转化效率的因素。结果表明:农杆菌细胞OD600约为0.6时冻融法和电击法的转化效率均较高。在利用冻融法转化农杆菌时,新制备的感受态细胞有利于提高转化效率。在进行电击法转化农杆菌时,电场强度和脉冲时间都对农杆菌的转化效率有影响。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

农杆菌介导法将LFY基因导入苹果的研究

以M26苹果叶片为外植体,利用GUS瞬时表达率,对农杆菌介导法转化苹果的因素进行优化,通过含LFY基因的根癌农杆菌EHA105转化苹果叶片,获得了提早开花的转基因植株。结果表明:以OD600=0.3~0.5农杆菌菌液侵染叶片,25℃条件下共培养,共培养后的叶片延迟筛选3 d,在附加卡那霉素30 mg/L的再生培养基中选择培养,转化芽再生率可达6.97%。PCR检测初步证明目的LFY基因已整合到苹果基因组中。     

反义AcInv基因转化马铃薯方法的研究

马铃薯反义AcInv基因,采用农杆菌介导法,选用生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,卡那霉素(Km)的适宜浓度为100 mg/L;生根过程中为50 mg/L。外植体的预培养为:茎段2 d,叶盘3 d效果较好;农杆菌浓度当OD600值为0.5时对茎段和叶盘的转化效果均较佳;茎段和叶盘侵染时间分别达8 min和10 min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2 d和3 d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上分化成苗,形成正常植株,植株再生率为11.2 %,PCR扩增检测表明大部分转基因植株为阳性。     

转基因杨树中农杆菌残存状况分析

以转发根农杆菌741杨为材料,在继代和移栽过程中对其残存农杆菌进行追踪检测。结果表明:培养基中附加头孢噻钨纳300 mg/L可将农杆菌基本抑制;随着转化植株在含抗生素培养基中继代时间的延长,残存农杆菌的数量和活性逐步下降,在继代18个月后,无法培养出目的菌落,但转化植株一旦脱离抗生素环境,农杆菌数量和活性又将得到恢复;残存农杆菌主要分布于植株体表和茎中,且影响组培苗PCR检测结果;将转化株系组培苗移栽到花盆半月和田间6个月后,植株体表、体内均未检测到目的农杆菌,但在室内培养半个月后2个株系根际土壤中检测到目的菌落。     

根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生

含双元载体pBEWMV的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)　LBA4404感染甜瓜（Cucumis melo）子叶外植体,获得了可育的转基因甜瓜植株。该质粒载体内含选择标记基因npt-Ⅱ（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）和WMV-Ⅰ CP基因（西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因）。NPT-Ⅱ酶活性检测、DNA分子点杂交、PCR检测及Southern杂交试验表明,外源的WMV-1 CP基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。     

根癌农杆菌介导转化抗虫基因获得转基因烟草

将抗虫ＰＩ基因构建到ｐＩＧ１２１Ｈｍ质粒的Ｔ－ＤＮＡ上，利用农杆菌ＬＢＡ４４０４介导转化烟草，获再生植株．经ＧＵＳ检测和Ｄｏｔｂｌｏｔ分析，证实外源基因已插入植物细胞基因组中，再生植株的转化率为６４．３％．