马MxA基因第12外显子多态性检测研究

[目的]建立检测马MxA基因第12外显子多态性的快速、准确方法。[方法]采用错配聚合酶链反应（mismatchPCR）对马MxA基因第12外显子进行扩增,对PCR产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）,鉴定MxA基因cDNA第1790位核苷酸点突变,并对PCR产物进行核苷酸序列分析。[结果]马MxA基因第12外显子区域存在AA、AB、BB3个基因型;位于cDNA序列第l790位点的碱基发生变异（由汕c）,引起了MxA蛋白编码区第562氨基酸由色氨酸变成半胱氨酸的变异;使用mismatchPCR—RFLP法所得PCR产物特异性序列,与RFLP分析结果相符。[结论]采用mismatch PCR—RFLP对马MxA基因12外显子的多态性进行检测操作简单,结果准确。     

绒山羊FGF5基因启动子至第二外显子片段的序列拼接及启动子的预测和序列分析

为构建绒山羊FGF5基因敲除载体及探明FGF5基因更多的序列信息,通过PCR方法分别扩增获得FGF5基因上游启动子至第一外显子1.6 kb片段、第一内含子至部分第二外显子8.0 kb片段及1.8 kb、2.4 kb和4.5 kb三段缺口片段。分别对以上PCR扩增片段进行测序,通过序列比对分析拼接获得了全长为9483 bp FGF5基因的部分序列,其结构包括编码区上游1 255 bp、第一外显子364 bp,第一内含子7 809 bp、部分第二外显子55 bp。并对绒山羊、绵羊、牛的FGF5基因启动子序列进行了分析,结果显示绒山羊和绵羊只有5个核苷酸的差异,而与牛的序列比较发现差异较大,牛的启动子中缺失了一个24 bp的DNA序列。本研究获得了绒山羊FGF5基因启动子至第二外显子部分序列的共9 483 bp的序列,为构建绒山羊FGF5基因敲除载体及探究FGF5基因的功能奠定了基础。     

牦牛PIT-1基因第5、6外显子部分序列的克隆测序

利用PCR方法扩增了麦洼牦牛PIT-1基因第5、6外显子的部分序列,扩增片段长度为1 285 bp,克隆到PND-18载体中进行测序,结果牦牛与普通牛的PIT-1基因有97%的同源性,共有28处不同,其中在内含子5的347处有18个碱基的缺失,565处有4个碱基的插入;外显子6有一个碱基突变,并导致氨基酸由普通牛的Thr变为牦牛的Arg。对61头麦洼牦牛和30头九龙牦牛PIT-1基因部分序列进行PCR-RFLP分析,均未检测到多态性。     

牦牛FSHR基因第10外显子的序列测定及比较研究

为探讨牦牛FSHR基因的序列特征,揭示该基因的变异和对家畜产子率的意义,应用PCR克隆技术,测定了牦牛、中国西门塔尔牛和小尾寒羊的FSHR基因第10外显子+1393+2125位点间序列,进行了比较研究。结果表明:三畜种扩增区段的序列长度一致,但存在碱基突变,碱基变异率分别为:牦牛与中国西门塔尔牛1.12 %;牦牛与小尾寒羊2.88 %;中国西门塔尔牛与小尾寒羊2.59 %。牦牛序列与中国西门塔尔牛序列间有2处错义突变;牦牛序列与小尾寒羊序列有5处错义突变,错义突变位点数多于中国西门塔尔牛与小尾寒羊序列间的错义突变位点数。三畜种的碱基错义突变数目与它们产双胎率高低的趋势相一致。错义突变导致的第660位点氨基酸替换,牦牛和中国西门塔尔牛以可磷酸化的丝氨酸替代了小尾寒羊的苯丙氨酸。     

辽宁绒山羊卵泡中FSHR基因表达研究

以β-Actin作为内源性内标,采用RT-PCR技术,研究了辽宁绒山羊不同发育时期卵泡FSHR基因mRNA的表达丰度。结果表明:辽宁绒山羊和本地山羊相同发育阶段卵泡FSHR基因表达水平差异不显著(P>0.05),随着卵泡发育,其表达水平的变化趋势也相一致;辽宁绒山羊直径<1mm卵泡和直径为3～4mm卵泡的颗粒细胞FSHR基因mRNA表达水平显著高于膜细胞。     

金定鸭FSHR基因第1～7外显子的克隆及SNP位点的筛查

动物的繁殖活动主要受内分泌生殖激素的调控,FSHR存在于卵泡颗粒细胞膜上,属于G蛋白偶联受体家族,对动物卵巢细胞的发育、成熟和排卵具有重要的作用。本研究以高产和低产金定鸭基因组为模板,通过PCR扩增、目的基因片段克隆和测序等方法,获取金定鸭FSHR基因1~7外显子序列,并对基因序列进行比对分析。结果显示,序列a包含第1外显子(185bp)的完整序列,第1内含子(145bp)的部分序列;序列b包含第2(75bp)、3外显子(75bp)、第2内含子(463bp)的完整序列,第1(40bp)、3内含子(47bp)的部分序列;序列c包含第4外显子(75bp)的完整序列,第3(180bp)、4内含子(55bp)的部分序列;序列d包含第5外显子(78bp)的完整序列,第4(232bp)、5内含子(56bp)的部分序列;序列e包含第6(69bp)、7外显子(75bp)、第6内含子(117bp)的完整序列,第5(133bp)、7内含子(146bp)的部分序列。根据基因序列特征,对获取的5段金定鸭FSHR基因序列进行扩增序列测序比对。结果发现:在外显子1第50bp处存在A/G突变;在外显子2第30bp处存在A/G突变;在外显子4第33bp处存在C/T突变;在外显子5第45bp处存在A/G突变,第19bp处可能存在A/T突变,33bp处可能存在C/T突变。金定鸭FSHR基因序列的克隆及SNP突变位点的发现可为后续开展FSHR基因的多态性与金定鸭产蛋性能的相关研究奠定一定的基础。     

内蒙古绒山羊MTNRla基因外显子2克隆及序列分析

依据已发表的绵羊MTNRla基因外显子2扩增引物序列,以内蒙古绒山羊基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到824bp的基因序列,将扩增产物进行克隆测序后与GenBank数据库进行序列同源性比较分析,结果表明,绒山羊MTNRla外显子2扩增序列与已发表的山羊同源性为99.2%,与绵羊、牛、人、鼠同源性分别为98.5%、96.8%、82.O%和78.4%,内蒙古绒山羊MNTRla基因第2外显子氨基酸序列与已发表的山羊氨基酸序列的同源性为97.7%,与已发表的绵羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分别为94.1%、91.8%、82.2%、83.1%.     

FSHR基因第10外显子SNP的筛选及其与兔体质量性状的关联性分析

[目的]近年来,研究发现FSHR基因在非性腺组织中也有表达,能够介导FSH信号参与调控机体内多项生理活动.FSH-FSHR信号与脂肪沉积、体质量存在一定关联,但有关FSHR基因与兔体质量性状的关联还未见报道.[方法]本研究以天府黑兔为研究对象,采用PCR产物直接测序的方法对其FSHR基因第10外显子进行SNP筛选,并将...     

贵州白山羊ALK6基因6个外显子的多态性分析

活化素受体样激酶(Activin receptor-like kinases 6,ALK6)是转移生长因子β超家族成员的受体,具有介导细胞发育和分化等重要功能。以人的ALK6蛋白结构域分析为依据,设计了6对特异性引物,再以贵州白山羊血液基因组DNA为模板,扩增出ALK6基因外显子5至外显子10相应的DNA片段。对6个外显子进行SSCP和RFLP分析,结果表明:ALK6基因外显子5至外显子10中没有发现单碱基突变,说明在绵羊、人等ALK6基因中发现的碱基突变在贵州白山羊中的自然发生率极低,该基因在贵州白山羊群体中很保守,其保守性对山羊的发育调控具有重要的意义。     

马MxA基因第13外显子的多态性研究

[目的]研究4个品种马MxA基因第13外显子的多态性。[方法]根据GenBank中已公布的MxA基因序列设计引物,利用PCR技术从三河马、锡尼河马、乌审马和巴尔虎马血液基因组DNA中扩增MxA第13外显子基因片段,利用PCR-SSCP方法检测该基因片段多态性并进行测序。[结果]只有乌审马MxA基因第13外显子存在多态性,第2 018位点发生了突变,鸟嘌呤（G）→腺嘌呤（A）,由此导致氨基酸发生改变,由谷氨酸（G lu）→丙氨酸（A la）。[结论]该研究为探讨马MxA蛋白基因抗病毒作用奠定了基础。     

金堂黑山羊FSHR启动子克隆及转录活性分析

[目的]分析金堂黑山羊FSHR启动子的克隆和转录活性,为分子水平研究金堂黑山羊FSHR的可变剪接提供基础。[方法]从金堂黑山羊子宫中提取总的DNA,设计1对引物用于扩增FSHR启动子片段,并进行测序和同源性分析。将克隆得到的FSHR启动子片段替换CMV启动子构建pcFSHRB2表达载体,分别将pcFSHRB1和pcFSHRB2表达载体转染到HEK293细胞中,用2mIU/mlFSH处理细胞,在处理后24、48h分别检测环磷酸腺苷（cAMP）的产量,用以分析FSHR的转录活性。[结果]克隆得到的FSHR启动子序列与鸡和家鼠的同源性分别为34.2%和41.6%,推测其转录起始位点为-576bp处,其上游含有2个TATA-box、4个CAAT-box、1个E-box和1个W1-box。所构建的pcFSHRB2和pcFSHRB1表达载体转染细胞后用FSH处理24和48h时产生的cAMP的量分别为299.5813、125.5281pmol/L和120.0571、109.9407pmol/L。[结论]金堂黑山羊的FSHR启动子是一个典型的Ⅱ型真核启动子,是一个强启动子。     

鸡H-FABP基因外显子2的PCR-SSCP分析

实验选用4个地方品种:清远麻鸡、惠阳三黄胡须鸡、封开杏花鸡、广西霞烟鸡以及3个近年培育的品系:岭南黄快大Ⅱ号配套系、矮小鸡E4专门化品系、AA配套系为材料(每个品种或品系各取5个个体,共35个个体)。采用PCR-SSCP结合DNA测序技术,对H-FABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)基因第2外显子区进行了单核苷酸多态性(SNP)分析。结果表明:在第一内含子区含有丰富的SNP位点:580 bp(T→G)、595 bp(A→C)、610 bp(C→-)、617 bp(A→G)、622 bp(A→T)、625 bp(A→-)、627 bp(A→C)、629 bp(A→C)、631 bp(A→C)、677 bp(G→A)和1个双碱基突变586~587 bp(TG→CA);在第二外显子区发现了一个非SNP位点785 bp(C→T);这表明在外显子2上本实验所选品种的序列之间没有差异,但与GenBank上登录号为AY648562的序列相比存在变异。此外在第二内含子区也发现了一个非SNP位点:1018 bp(C→T)。这为进一步分析H-FABP基因的遗传变异及其与肉质性状的相关性以及将该分子标记应用于育种计划奠定一定的理论基础。     

人乳腺组织中乳铁蛋白基因cDNA的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从人乳腺癌组织中扩增出长度为2259 bp的人乳铁蛋白cDNA,PCR产物经凝胶回收纯化后,克隆在pMD 18-T载体的T位点。测序结果和序列分析显示,与GenBank中收录的人、小鼠、奶牛和山羊的乳铁蛋白cDNA序列的同源性分别为99．73％,82．19％,81．79％和87．28％。其中与人乳铁蛋白cDNA 序列相比,发现有5个碱基因等位基因间的突变而发生变异,1个碱基发生了未知的突变,表明已成功的扩增、克隆了人乳铁蛋白基因cDNA序列,此基因序列的GenBank登录号为AY165046。     

山羊PRNP基因启动子转录活性研究

【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。     

北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因外显子2的克隆与序列分析

采用PCR技术扩增出北京荷斯坦母牛BoLA-DRB3基因的外显子2的267 bp大小的片段,将该片段克隆到pGEM-T Easy质粒中,重组质粒用PCR和酶切分析进行阳性克隆鉴定,然后测定核苷酸序列,并推导其氨基酸序列.北京荷斯坦牛、蒙古牛、人类、瑞典红白花牛、蒙古绵羊、西班牙山羊之间DRB3基因外显子2的核苷酸序列同源性为80.9%～95.5%,氨基酸序列同源性为75.3%～91.0%.     

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。     

山羊GDF9基因多态性与产羔数关联分析研究

采用PCR-SSCP技术检测山羊GDF9基因外显子突变位点,发现编码序列第183 bp、719 bp、959 bp、1189bp处分别发生了C→A、C→T、A→C、G→A的单碱基突变。序列分析显示C183A突变没有引起氨基酸的改变,C719T突变使蛋白质第240位氨基酸残基由缬氨酸变为丙氨酸,A959C突变使第320位氨基酸残基由谷氨酰胺变为脯氨酸,G1189A突变导致第397位氨基酸残基由缬氨酸变为异亮氨酸。应用LDR技术对济宁青山羊(234只)、鲁北白山羊(90)只、沂蒙黑山羊(84只)进行GDF9四个突变位点的群体检测,利用SAS软件GLM过程对四个位点的基因型效应和产羔数进行了最小二乘分析,结果表明C183A突变对济宁青山羊和鲁北白山羊产羔数没有显著影响,但对沂蒙黑山羊的产羔数有显著影响(P<0.05),CC型产羔数比AC型多0.11只(P<0.05);C719T突变和A959C突变对济宁青山羊、鲁北白山羊、沂蒙黑山羊的产羔数均没有显著影响(P>0.05);G1189A突变对山羊产羔数没有显著影响(P>0.05),对鲁北白山羊产羔数有显著影响(P<0.05),AG型产羔数比AA型多0.42只(P<0.01),G1189A突变对沂蒙黑山羊产羔数有极显著影响(P<0.01),AA型产羔数分别比AG型、GG型多0.34只(P<0.05)、0.38只(P<0.05)。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

毛叶枣APETALA1同源基因的克隆

分析在植物花分子生组织及花器密形成过程中起重要作用的APETALA1（AP1）基因的保守区序列，设计1对长度为23pb的PCR引物，以毛叶枣基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出长为648bp的DNA片段，克隆人pUCm-T载体，测序和序列分析结果 表明获得了毛叶枣AP1同源基因中部的1个片段，该片段有2个内含子，长度分别为152bp和386pb，编码区共编码36个氨基酸，其序列已在GenBank中登记（登记号为AF356541）,在GenBank中进行同源性检索，结果表明其氨基酸序列与其他植物AP1同源基因的氨基酸序列同源性高达66％－88％，推测它们在功能上也是相似的。