农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究

以番茄品种组培大黄为试验材料,通过农杆菌介导法,将来自拟南芥的抗寒基因ICE1导入番茄,并对影响遗传转化的因素进行了优化。结果表明,高效稳定的遗传转化体系培养基为MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L;子叶预培养2d,农杆菌菌液浓度OD600=0.4,侵染10min,共培养36h,抑菌抗生素300mg/L。获得抗性植株5株,PCR扩增和RT-PCR检测表明有3株阳性植株,转化率为60%,初步表明ICE1基因已导入到番茄中。     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

根癌农杆菌介导白细胞介素-4基因转化甘蓝(Brassica oleracea L.)研究

利用根癌农杆菌介导法,以白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)基因转化中甘11号甘蓝.本研究对可能影响il-4转化率的外植体类型、外植体的预培养时间、农杆菌的侵染时间以及外植体与农杆菌的共培养时间进行了优化.试验结果表明:il-4基因对带1～2 mm子叶柄的子叶的转化率显著高于下胚轴;带柄子叶在预培养1 d、侵染3 min、共培养1 d时,转化效果最好,转化率达23.3%;下胚轴在预培养1～3 d,侵染3～5 min,共培养1～2 d时,转化效果较好,转化率最高可达13.3%.经PCR检测及PCR-Southern杂交,初步证明目的基因il-4已经转入甘蓝的再生植株.转il-4基因甘蓝的PCR阳性再生植株已经开花并产生了后代.     

蓖麻子叶节遗传转化研究

利用前期构建的P450基因的RNAi植物表达载体侵染蓖麻受体材料,旨在获得转P450基因的阳性株。以蓖麻品种通蓖5号为试验材料,利用根癌农杆菌介导法转化蓖麻子叶节,研究影响子叶节遗传转化的若干因素。结果表明:子叶节对Kan较为敏感,适宜筛选质量浓度为250 mg/L;外植体预培养2～3 d,侵染用农杆菌菌液OD600=0.8,侵染时间10 min,共培养3 d,可获得较高的遗传转化效率。再生植株经PCR和Southern Blot检测,证明为转基因植株。     

农杆菌介导BADH耐盐基因转化马铃薯的研究

以马铃薯品种费乌瑞它微型薯为外植体,采用农杆菌介导法将BADH耐盐基因导入马铃薯中,优化了影响遗传转化的因素,包括激素浓度、脱菌抗生素浓度、共培养时间、筛选剂浓度等。共获得30株PPT抗性植株,PCR检测10株为阳性植株,Southern检测4株为阳性植株。生理检测表明植株在0.7%NaCl浓度下耐盐性相对较高。证明外源基因已经整合到植物的基因组上。     

小对叶植株再生及遗传转化体系构建

为了利用生物技术方法开发及改良水生植物小对叶,以小对叶（Bacopa monnieri）叶片为外植体,建立其组织培养再生体系及根癌农杆菌介导的遗传转化体系。结果表明：小对叶叶盘最佳愈伤组织诱导培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.02 mg/L;最佳分化培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L;最佳生根培养基是1/2MS+IBA 0.1 mg/L。最佳的根癌农杆菌介导的小对叶遗传转化条件是：外植体预培养2天,侵染菌液OD600为0.5,侵染时间7 min、共培养4天和延迟筛选4天,可获得最高转化率21.4%。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

西瓜‘SM1’高效遗传转化体系的构建

为构建高效的西瓜再生和遗传转化体系,本研究以西瓜‘SM1’材料子叶节为外植体,研究不同激素配比对子叶节再生的影响。在此基础上,通过农杆菌介导法导入外源基因,研究潮霉素浓度、农杆菌侵染时间、共培养时间等因素对遗传转化效率的影响,建立遗传转化体系。结果表明,‘SM1’不定芽分化最佳培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L,不定芽分化率为91.7%。最优遗传转化组合为农杆菌侵染时间15 min,共培养3 d,之后进行选择培养。外植体不定芽分化潮霉素最适浓度为10 mg/L,最适生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.01 mg/L。通过潮霉素筛选和PCR鉴定,获得12株阳性转化株系,转化率为6.5%。本研究建立了高效西瓜‘SM1’再生及遗传转化体系,为进一步开展基因功能研究及西瓜遗传改良提供了技术支撑。     

农杆菌介导法获得桃叶卫矛转Bt基因植株

虫害一直是制约农林作物高产、优产和稳产的重要因素,开展植物抗虫性研究具有关键的理论和实践意义。本研究使用农杆菌介导法,以桃叶卫矛(Euonymus bungeanus Maxim.)的愈伤组织为外植体材料,研究农杆菌的菌液浓度、侵染时间及共培养时间对桃叶卫矛叶片愈伤组织转化效率所产生的影响;并在建立的最佳转化体系下将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt基因及豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea trypsin inhibitor) SCK基因导入桃叶卫矛中,最终获得稳定表达的转化植株。结果显示,在侵染菌液OD_(600)=0.5～0.6,侵染时间30 min,共培养5 d的条件下,桃叶卫矛叶片愈伤组织的转化效率最好,经PCR鉴定检测后,在23株抗性植株中有10株同时检测到两个抗虫基因的表达,证明外源抗虫基因已导入桃叶卫矛基因组中。本研究将为卫矛科植物的抗虫性育种工作提供一定的理论基础。     

罗汉果遗传转化体系的建立

本研究以罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffery)子叶为外植体,通过农杆菌介导法,探讨影响罗汉果转化的几个重要因素,建立罗汉果稳定的遗传转化再生体系。结果表明:农杆菌转化前对子叶进行预培养可以促进细胞分裂,预培养的最佳时间为1d,侵染时间以为20～30min为宜,共培养最佳时间为4d,附加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)可促进转化。通过潮霉素抗性不定芽分化和抗性不定根分化的两轮筛选及PCR检测,获得56株PCR阳性植株,阳性转基因植株频率为6.86%,初步证明目的基因已经整合到罗汉果基因组中。     

甘蓝型黄籽油菜自交系转化体系的建立

利用黄籽甘蓝型油菜自交系建立和优化了遗传转化系统。首先构建了由质粒pCNR与Δ6脂肪酸脱氢酶基因插入到植物的高效表达载体pCAMBIA2301G。利用在Murashige和Skoog培养基(含有200 mmol L^–1乙酰丁香酮)培养5~7 d的下胚轴外植体与农杆菌株LBA4404共培养63~69 h (pCNR),再于芽诱导培养基上培养3个月诱导芽再生。在最佳条件下,平均转化效率约为1.3%。转化植株的GUS分析和PCR分析结果表明,外源基因成功导入甘蓝型油菜。Southern杂交表明,这些转化子含有目标基因1~2个拷贝。用气相色谱分析转基因植物种子的脂肪酸,γ-亚麻酸含量达8.2%。     

Regeneration of Chinese cabbage transgenic plants expressing antibacterial peptide gene and cowpea trypsin inhibitor gene

Summary An efficient transformation system for Chinese cabbage cotyledon explants was developed using Agrobacterium tumefaciens strains LBA4404 harbouring the plasmid pMOG 411 and the plasmid pBinΩSCK respectively. Various factors affecting the transformation efficiency and subsequent regeneration were identified. The age of seedlings, growth conditions and status of Agrobacterium suspension, preculture of explants, cocultivation time, ratio between Agrobacterium and explants, acetosyringone and concentration of kanamycin had a significant influence on transformation frequency and plant regeneration. The presences of the antibacterial peptide gene and the cowpea trypsin inhibitor gene in those selected shoots in kanamycin medium were confirmed by PCR, Southern blotting and Northern blotting, The frequency of regeneration from cotyledons was analyzed in eight parental lines of Chinese cabbage and five lines were suitable for obtaining transformed plants, among which Qingmaye C and Qingmaye D were more responsive than other lines.     

农杆菌介导谷子成熟胚遗传转化体系的建立与优化

为建立一个稳定的谷子遗传转化体系,对216份谷子种质资源进行筛选,确定材料178成熟胚为受体材料,从植物激素浓度、防褐化剂、农杆菌菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（AS）浓度等方面对谷子再生及转化体系进行优化。结果表明,在MS培养基中加入生长素2,4-D 9μmol/L、细胞分裂素Kinetin 4μmol/L、硝酸银8mg/L,愈伤组织诱导率最高且能有效防止褐化。在侵染液和共培养基中加入100μmol/L AS,gus表达效果最好。农杆菌溶液OD₆₀₀为0.3~0.5,侵染15min,共培养3d时,抗性愈伤组织率最高。获得的转基因植株,经PCR检测及gus染色分析,确定外源bar基因已成功整合到谷子基因组中。初步建立了一套谷子遗传转化体系,为今后谷子遗传转化提供一些参考。     

玉米淀粉分支酶SBEIIb基因遗传转化玉米自交系的研究

以玉米自交系丹黄25为试材,用农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶SBEIIb基因转入玉米中,探讨了农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素.结果表明:愈伤组织经过9d的继代,菌液中乙酰丁香酮(AS)浓度为10 mg/L,侵染时间为20 min,共培养60 h为最佳转化条件.获得的4株再生植株经PCR分析鉴定,其中3株表现阳性,证...     

根癌农杆菌介导的花魔芋遗传转化体系的研究

本研究以潮霉素抗性基因为选择标记,建立了根癌农杆菌介导的花魔芋(Amorphophalluskonjac)的遗传转化体系。同时探讨了魔芋愈伤组织的培养基、筛选剂和筛选时间等因素对转化效率的影响。通过筛选时间不同的两个转化试验,分别从300个花魔芋愈伤组织中得到了16个和18个具有潮霉素抗性的愈伤组织,其抗性愈伤率为5.33%和6.00%。获得的抗性愈伤组织进一步在分化培养基上进行分化,其分化效率分别为31.2%和22.2%。移栽后,分别得到了39株和36株成活植株。PCR检测表明分别有26株和21株再生花魔芋出现了800bp的特异性扩增带型,其阳性率分别为66.7%和58.3%。随机挑取20个PCR阳性植株的DNA进行斑点杂交检测,结果表明外源基因已经整合到花魔芋的基因组中。     

葡萄糖氧化酶基因转化棉花和抗性愈伤组织的获得

用葡萄糖氧化酶基因转化棉花 ,研究了影响转化和抗性愈伤组织获得的因素。结果表明 ,基因型和培养基构成是影响葡萄糖氧化酶基因转化棉花获得抗性愈伤组织的最关键因素 ,在本试验所采用的 8个基因型中 ,中棉所 1 3中 940 9(中棉所3 5)和中棉所 1 9较易诱导获得抗性愈伤组织 ,而珂字 2 0 1、中棉所 2 7等则较难 ;用于棉花遗传转化的感染时间以 7～ 1 0 min为宜 ,共培养时间以48h为宜 ;下胚轴比子叶易诱导获得抗性愈伤组织。在诱导愈伤组织的继代培养中 ,加入高浓度的卡那霉素是获得转化细胞的关键 ;用液体培养比用固体培养易筛选获得抗性转化愈伤组织     

农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化

旨在通过对农杆菌介导的地黄遗传转化体系影响因子的研究,探索最佳转化条件,为建立高效地黄遗传转化体系奠定基础。利用正交实验,通过检测地黄叶片中gus基因瞬时表达情况,对地黄遗传转化效率的决定因子进行了系统研究。正交试验表明,地黄遗传转化过程对转化效率影响程度从高到低的因素依次为：共培养时间、预培养时间、菌液浓度和侵染时间;以地黄叶片为外植体,材料不经过预培养,菌液OD600值为0.6,侵染时间5 min,并在培养基中添加100 μM乙酰丁香酮,共培养3天条件下可达最高转化效率,gus基因瞬时表达率可达65.63%。通过对根癌农杆菌介导的地黄遗传转化体系的优化,建立了高效的瞬时表达转化体系。     

棉花农杆菌介导转化体系中影响抗性愈伤组织诱导率的因素

 以冀无2031为材料,采用正交设计方法,研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明,4个因素均对抗性愈伤的诱导率有极显著影响,其诱导效应依次是共培养温度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。按照正交设计的原则,最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是：菌液OD值为0.3,侵染15 min,24 ℃共培养24 h,下胚轴抗性愈伤的转化效率最高。用珂312、中521和农大94-7对所选出的最佳组合进行了进一步验证,结果3个品种在优选组合下的抗性愈伤组织诱导率都很高,分别为93.85%、86.72%和85.83%。     

4种地被菊再生及遗传转化条件的比较

为建立地被菊‘神韵’、‘繁星粉’、‘都市丽人’和‘粉玫瑰’的离体再生体系,明确其遗传转化条件,为通过转基因技术培育地被菊新品种奠定基础,以叶片为外植体,研究了激素配比对4种地被菊再生芽诱导的影响;通过农杆菌介导比较了4种地被菊的遗传转化条件。研究结果表明,‘神韵’、‘繁星粉’、‘都市丽人’和‘粉玫瑰’可分别在含有NAA 1.0 mg/L+ BA 1.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L+ BA 1.0 mg/L、NAA 1.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L+ BA 1.5 mg/L的MS培养基上获得最佳分化率;其叶片外植体的遗传转化条件为24 h预培养、OD600分别为0.4、0.5、0.3和0.4的农杆菌侵染10 min、共培养48 h、延迟培养2天、甘露糖筛选浓度为10 g/L、头孢霉素抑菌浓度为300 mg/L。部分抗性植株经PCR检测获得了目的条带,初步证明目的基因已经整合到4种地被菊的基因组中。