DNA免疫法制备猪圆环病毒2型ORF3抗体

为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的克隆与表达

猪圆环病毒II型(PCV2)是引起断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的重要病原。本研究用PCR方法扩增PCV2截短的ORF2基因并亚克隆至表达载体pGEX-6P-1,构建的重组表达质粒命名为pGEX-ORF2,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),在37℃经IPTG诱导4小时。PCV2的cap蛋白以包涵体形式得到有效表达。经SDS-PAGE及Western blot分析表明表达的重组蛋白分子量约为46KD,重组蛋白具有良好的免疫学活性。     

猪流感H3N2亚型HA 基因真核表达载体构建及其对小鼠的免疫效果的研究

采用PCR方法扩增出猪流感病毒四川分离株H3N2亚型HA全基因,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,成功构建出真核重组质粒pcDNA3.1-HA.采用纯化后的pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒以不同的组合免疫4～6周龄的Balb/c小鼠,免疫2次间隔3周,加强免疫3周后,小鼠接种致死量的H3N2病毒;检测免疫后小鼠的血清抗体水平及攻毒后肺部病毒残留.结果表明,pcDNA3.1-HA质粒和灭活全病毒免疫小鼠后,均能够产生一定的免疫效果,能为小鼠提供H3N2亚型猪流感病毒保护.     

锦鲤疱疹病毒ORF1基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为了进行锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus Virus,KHV)诊断方法、疫苗研制和蛋白功能研究。通过选择基因保守性极强的ORF1基因作为研究对象,设计1对特异性引物进行PCR克隆。目的基因与表达载体PET构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)后诱导表达。再将成功表达的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。PCR产物经电泳显示,所扩增的基因长度774 bp,与目的基因长度相符。蛋白表达产物经SDS-PAGE和Western-bolt检测,重组表达质粒K1-PET成功诱导表达,表达蛋白为37.3 KD为包涵体。免疫小鼠获得多克隆抗体,经酶联免疫检测发现其效价达到1:27000,表明表达出的目的蛋白具有免疫原性,实验获得的表达蛋白和多抗血清为KHV的疫苗研制和免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

犬SLAM基因真核表达载体的构建及Vero细胞系转染的研究

为了研究犬瘟热病毒细胞受体SLAM基因的特性和功能。将基因SLAM克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建真核表达载体pCDNA3.1/SLAM,重组质粒纯化后应用脂质体2000转染到Vero细胞中,通过RT-PCR和免疫印迹方法检测犬SLAM基因在Vero细胞中的转录和表达情况。结果表明：成功构建了表达SLAM基因的真核表达载体,RT-PCR和免疫印迹显示SLAM基因获得表达;pcDNA3.1/SLAM载体的构建为研究犬SLAM基因在Vero细胞中的稳定表达奠定了基础。     

猪瘟病毒DNA疫苗的构建及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒（CSFV） C株E2囊膜蛋白全长基因克隆到真核表达载体pcDNA4.0的CMV启动子下游,采用磷酸钙转染法将重组质粒转入293T细胞,流式细胞仪(FACS)检测293T细胞瞬时表达了E2囊膜蛋白。将构建的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠,用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测证明成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体,为下一步利用DNA疫苗免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%～99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%～68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因在哺乳细胞中的表达

为构建O型口蹄疫病毒(FMDV)蛋白酶3C基因的真核表达质粒,并在BHK-21细胞中进行表达,以RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒蛋白酶3C基因,利用XhoⅠ和HindⅢ限制性内切酶将3C基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-),通过脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1(-)-3C。PCR,双酶切鉴定及测序结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C构建成功;Western-blot分析结果表明：重组质粒pcDNA3.1(-)-3C在BHK-21细胞中能够表达O型FMDV蛋白酶3C基因。该真核表达质粒的构建,为进一步研究O型口蹄疫空衣壳的体外组装以及O型口蹄疫空衣壳疫苗的开发建立了实验基础。     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因在真核细胞中表达及动物免疫试验初报

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒表达载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在SP2/0细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,用流式细胞仪检测证明,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。为下一步利用细胞免疫小鼠研制抗猪瘟病毒单克隆抗体打下基础。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

湖羊myogenin重组基因表达及其亚细胞定位的研究

摘 要： [目的]构建湖羊肌细胞生成素（myogenin,MyoG）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白真核表达载体,分析EGFP-MyoG融合蛋白在NIH-3T3细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用PCR技术扩增出MyoG基因完整的CDS,克隆至真核表达载体pEGFP-C1,转染NIH-3T3细胞,荧光显微镜下观察EGFP-MyoG融合蛋白的亚细胞定位,并通过RT-PCR、western blot检测蛋白的表达。[结果]酶切鉴定和DNA序列分析均证实,MyoG基因已正确插入pEGFP-C1中,获得融合蛋白表达载体pEGFP-C1-MyoG,转染NIH-3T3细胞48h后,RT-PCR检测到约680bp的特异性条带,western blot检测出相对分子量约为53kD的融合蛋白,荧光显微镜分析表明,MyoG蛋白定位于细胞核。[结论]融合蛋白EGFP-MyoG在NIH-3T3细胞中成功表达,并定位于细胞核。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP3蛋白的原核表达与纯化

根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 5.0软件设计合成了1对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为765 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF3的阳性克隆pTG19-T-GP3.将此基因亚克隆到原核表达载体pET-32a,经筛选获得了阳性重组质粒pET-GP3,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kDa的融合蛋白GP3-His,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性.从而为进一步研究PRRSV次要结构蛋白GP3的免疫特性和功能奠定了基础.     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。