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为了制备猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框3(ORF3)蛋白的抗体,并为ORF3功能研究奠定基础,用PCR方法扩增PCV2 ORF3基因,对其PCR产物用EcoR I与Xho I进行酶切,并对真核表达载体pCDNA3.1(+)进行同样酶切,连接2种目的酶切产物后转化E.coli DH5?感受态,菌落PCR和序列测定结果显示成功构建出重组质粒pCDNA3.1-PCV2 ORF3。将该重组质粒接种BALB/c小鼠,用间接免疫荧光(IFA)检测小鼠血清PCV2 ORF3抗体的特异性及其效价。IFA结果证实经PCV2 ORF3重组质粒接种所制备的小鼠血清是PCV2 ORF3的特异性抗体,小鼠血清PCV2 ORF3抗体效价在经过4次接种后均达到1:25以上,表明,成功制备了具有较高效价的PCV2 ORF3抗体。研究结果提示,可以通过质粒DNA免疫方法来快速、简便地制备PCV2 ORF3抗体,为PCV2 ORF3抗体制备提供了一种新的有效途径。 相似文献
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河北地区猪圆环病毒二型ORF2基因片段的克隆与原核表达 总被引:2,自引:1,他引:2
以PCV2 PK-15细胞毒提取的DNA为模板,用PCR扩增PCV20RF2基因的后部约600 bp片段;对PCR产物回收纯化后与载体pMD19-T进行连接、转化,经酶切和序列分析后亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-ORF2,转入大肠埃希氏菌B121(DE3)中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳和Western-Blotting分析.结果表明.重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40 kDa,Western-blotting分析表明该蛋白具有PCV2抗原性. 相似文献
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【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1 ORF2基因的同源性介于97.3% ~ 99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9% ~ 68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性 相似文献
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一株新基因型猪圆环病毒II型的鉴定 总被引:1,自引:1,他引:0
为了解新近出现的猪圆环病毒II型(PCV2)的基因变异及其基因型信息。用PCR技术从新近发生断奶后多系统消耗综合征的病猪组织中扩增和克隆出一株PCV2全基因组序列,并进行了遗传变异分析。结果显示:该PCV2毒株基因组全长为1767 bp,与部分其他PCV2毒株的核苷酸同源性达94.0%以上,并显示出一定的地域、时间相关性。病毒ORF2基因系统发育进化分析显示:该PCV2毒株与已有PCV2基因型的遗传距离均大于0.035,因而被划入到一个新的PCV2基因型,暂命名为PCV2d,属于在中国新近出现的一种PCV2基因型。研究结果表明,克隆鉴定了一株新基因型PCV2。 相似文献
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根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计一对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出PCV1ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒pMD-PCV1-ORF2并对其测序,结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与Genbank上发表的PCV1ORF2基因的同源性介于97.3%~99.9%,与PCV2-ORF2基因同源性介于67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区域比较保守;抗原表位预测表明PCV1ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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为了探讨猪圆环病毒II型(PCV2)感染对伪狂犬病病毒(PRV)疫苗体液免疫反应的影响,检测了PCV2实验感染仔猪血清中PRV疫苗抗体含量的动态变化。将仔猪随机分成二组,一组仔猪进行PCV2接种和PRV疫苗免疫而作为PCV2组;另一组仔猪不予PCV2接种但进行PRV疫苗免疫而作为对照组。所有仔猪在PCV2接种后14天均进行PRV弱毒疫苗免疫,用间接ELISA检测仔猪血清中病毒特异性抗体;到PCV2接种后14天,PCV2组仔猪全部出现PCV2病毒血症。在PRV疫苗免疫后7天,多数仔猪血清中可检测到疫苗抗体之后疫苗抗体含量逐渐上升,在免疫后14天时对照组疫苗抗体水平显著(P<0.05)高于PCV2组,但在免疫后21天时两组之间抗体水平没有差异。研究结果显示:PCV2实验感染仔猪的PRV疫苗抗体产生出现延迟,表明PCV2感染可抑制PRV疫苗诱导的体液免疫反应。 相似文献
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为了猪圆环病毒2型(PCV2)抗体,本研究建立了快速、敏感的ELISA诊断方法。本研究应用原核表达的PCV2-Cap蛋白作为包被抗原,通过抗原最适包被浓度和兔抗猪IgG最佳稀释浓度的确定,待检血清稀释度的选择,阴阳性临界值的确定,然后进行特异性测定、重复性测定和符合率比较等,建立检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果显示,建立的间接ELISA方法只能检测出PCV2阳性血清;3次重复性试验的差异不显著;与韩国JBT公司的PCV2试剂盒的符合率达到了92.5%;对采集福建省内多个猪场204份血清样品进行检测,其阳性率达到了76.5%。实验表明,建立的检测PCV2抗体的间接ELISA方法具有特异性强、重复性和稳定性好的特点,可用于PCV2抗体的血清学诊断和流行病学调查。 相似文献
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为了获得重组猪OGP蛋白,构建OGP分泌表达载体,以使猪输卵管特异性糖蛋白在体外受精中发挥重要作用。从猪输卵管中提取总RNA,运用RT-PCR技术扩增猪OGP全部编码序列,克隆到pET22b载体中,构建成pET22b-OGP分泌表达载体,对其进行酶切、PCR和测序鉴定。结果表明:成功构建了OGP分泌表达载体,为进一步研究该OGP在猪体外受精中的功能奠定了基础。 相似文献
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溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核载体构建、表达条件优化及多克隆抗体制备 总被引:1,自引:0,他引:1
为构建水产致病菌溶藻弧菌附着定植因子ACFA原核表达载体,优化ACFA蛋白的诱导表达条件,制备ACFA蛋白小鼠多克隆抗体。通过分子克隆获得ACFA蛋白的表达菌株,利用切胶纯化获得ACFA蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度为1∶3 200倍,Western-Blotting法检测抗血清特异性较好。通过正交试验,获得ACFA菌株的最佳表达条件为:诱导时菌液OD600值0.5,加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时间8 h,诱导温度32℃;最佳培养条件为:葡萄糖浓度0,转速230 r/min,装液量50 m L。 相似文献
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摘 要: 【目的】 构建表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌并进行验证。 【方法】 对流产布鲁氏菌疫苗株S19外膜蛋白基因omp25设计特异引物进行PCR扩增,连接到pGM-T载体上,获得pGM-T-omp25,进行PCR扩增、酶切、测序鉴定。将质粒pGM-T-omp25与pGBKT7载体进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切,回收DNA片段,并进行连接,构建pGBKT7-omp25后,转化酿酒酵母菌Y187,并进行PCR鉴定、自激活实验和毒性检测。 【结果】 克隆了流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25,PCR、酶切、测序表明成功构建了pGBKT7-omp25真核表达载体,获得的转化子酵母Y187菌株无自激活活性,无毒性。 【结论】 成功构建了表达流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的酿酒酵母表达菌,为揭示流产布鲁氏菌感染与母畜流产间的分子机制奠定基础。关键词:流产布鲁氏菌;基因omp25;酿酒酵母Y187;真核表达 相似文献
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【目的】构建水貂生长激素(mGH)基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量(31kd)相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。 相似文献