巴西橡胶树单个花粉细胞显微分离

巴西橡胶树是一种重要的热带产胶作物。因巴西橡胶树基因高度杂合,容易受到遗传或环境影响,为了不受群体效应的干扰,以巴西橡胶树‘热研7-33-97’的幼嫩雄花为试验材料,利用显微分离技术获取单个花粉细胞,使用5%纤维素酶+4%果胶酶混合酶和8%纤维素酶+6%果胶酶+3%蜗牛酶混合酶在不同条件(温度,时间)下,探索花粉细胞壁的最佳酶解体系。结果表明：8%纤维素酶、6%果胶酶和3%蜗牛酶混合酶在42℃条件下水浴15 h酶解效果最佳;同时利用随机引物(S2147和S1402)对酶解后的单个细胞进行酶解去壁效果的RAPD-PCR扩增鉴定,结果揭示该酶解体系能对花粉细胞进行去壁,使核酸物质得以释放并扩增。本试验以单个花粉细胞为研究对象,进行花粉细胞的显微分离,酶解去壁及RAPD-PCR扩增鉴定,为后续进一步开展‘热研7-33-97’单细胞全基因组测序、构建遗传图谱及橡胶树分子辅助育种等提供了科学依据。     

生物腐植酸对土壤碳组分的影响

土壤碳含量是评价土壤质量的重要指标,对土壤物理、化学以及生物学性质都有重要的影响。增加土壤碳的含量不但有助于农业生产的可持续发展,而且对整个地球生态系统的物质循环也有着至关重要的作用。笔者研究了从有机废弃物发酵产物中提取的生物腐植酸对土壤碳组分的影响。结果表明：腐植酸、有机肥均能在一定程度上显著增加土壤总有机碳的含量,其中腐植酸+化肥处理能在较长的时间内（10~40天）保持土壤有机碳含量,其土壤有机碳碳含量增加了1.6%~10.5%。不同施肥处理土壤水溶性有机碳含量存在差异,与对照相比,腐植酸+化肥处理土壤水溶性碳含量增加了2.7%~20.1%。施肥处理能保持土壤微生物生物量碳含量,腐植酸添加量为400 mg/kg时施肥处理土壤微生物生物量碳含量显著高于对照处理。     

巴西橡胶树单染色体显微分离及其两种体外扩增方法比较

以巴西橡胶热研7-33-97古铜期嫩叶为材料,采用酶解去壁低渗法来制备中期染色体标本,及利用显微分离方法随机分离橡胶树单条染色体,分离后的单染色体分别用接头引物介导PCR(LA-PCR)和单细胞全基因组扩增方法进行体外扩增。结果表明:经LA-PCR扩增获得了200~2 500 bp之间的DNA片段,单细胞全基因组扩增后产物大小为300~2 500 bp。对橡胶基因组DNA酶切后制备探针,经Southern杂交证实了扩增产物均来自橡胶树基因组。单细胞全基因组扩增法相比较于LA-PCR,具有操作简单、用时短、扩增片段长、产物适用多个平台等优点,将更适用于单条染色体高通量测序等相关方面的研究。     

柚单染色体微分离制片技术研究

以‘琯溪蜜柚’幼胚为材料,对单染色体微分离制片过程中酶解时间、冰水固缩时间和染色三因素的影响效果进行了研究。结果表明：用2%纤维素酶与0.5%果胶酶的混合液处理40～60 min,后低渗处理之后进行20～30 min冰水固缩处理和卡宝品红染色组合可以得到理想的制片效果。该方法制片背景干净,各单染色体充分分散,适合下一步的小型单染色体微分离研究     

巴西橡胶树小孢子单细胞体外扩增体系的优化

高质量单细胞的获得且进行高效率的扩增是单细胞测序的前提,而植物细胞因为存在细胞壁使得单细胞扩增变得困难。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’幼嫩雄花为试验材料,使用5种不同的酶液在不同的时间和渗透压稳定剂下探索获得高质量且易扩增的巴西橡胶树小孢子单细胞,同时对单细胞扩增过程进行相应的探索优化。结果表明,使用8%纤维素酶+6%果胶酶+3%蜗牛酶混合酶,0.6 mol/L甘露醇作为渗透压稳定剂,37℃酶解45 min后可以得到品质优良的巴西橡胶树小孢子单细胞;单细胞扩增过程确定细胞裂解酶用量为0.5μL,细胞裂解时间为80 min,预扩增循环数为10个循环,可以得到准确且覆盖度高的单细胞扩增产物,经Dot-blot杂交验证其确实来自于巴西橡胶树基因组。本研究为后续巴西橡胶树单细胞全基因组测序,构建巴西橡胶树高分辨SNP遗传图谱提供基础性技术支持。     

巴西橡胶树HbAPXs基因家族6个成员的染色体物理定位

抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)是活性氧清除系统的重要成员之一,会对细胞的结构以及功能产生危害.为了揭示HbAPXs基因家族中的6个成员位于巴西橡胶树的细胞核染色体上的具体位置,展现HbAPXs家族基因6个成员之间的分布情况.本研究采用荧光原位杂交技术(fluorescence i...     

巴西橡胶树HbDBB家族基因的鉴定与表达分析

本研究从橡胶树基因组中鉴定到9个HbDBB家族基因,并对这些基因的基因结构、启动子调控元件、染色体定位、进化和表达进行分析。结果显示,HbDBB家族成员分布在七条染色体和一个Contig上,编码蛋白的氨基酸数目为171～453个,分子量在18.20～50.13 kD,启动子区域含有多种植物激素和环境胁迫应答相关作用元件。系统进化分析表明DBB可以分成4个亚组,亚组成员在基因结构、保守基序数目和相对位置等方面具有较高相似性。表达分析显示HbDBB具有组织表达特异性,胶乳中HbDBB4和HbDBB6表达水平最高,叶片中HbDBB3和HbDBB4的表达水平最高。增产处理实验表明,HbDBB2、HbDBB4和HbDBB6受乙烯诱导,Hb DBB6受割胶诱导但不明显。叶片发育过程中,HbDBB3、HbDBB4和HbDBB9随着发育进程表达上调。本研究初步揭示了橡胶树DBB家族成员的理化特征和表达特性,为进一步研究该基因在橡胶树中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树雄性不育相关基因HbGEX1的克隆与表达分析

蛋白配子表达1项目(Protein GAMETE EXPRESSED 1, GEX1)是一种膜蛋白,在植物物种中非常保守。本研究前期利用转录组测序技术筛选得到了与橡胶树雄性不育相关的差异表达基因GEX1序列,但其相关功能并未得到验证。本研究通过RT-PCR方法从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆得到一个GEX1的全长c DNA序列,命名为HbGEX1,其ORF长度为1 785 bp,编码594个氨基酸,理论等电点为5.51,相对分子质量为68.66 k D,总平均亲水性GRAVY为负值,为疏水性蛋白,亚细胞定位预测结果表明定位于细胞核中不是分泌蛋白,Hb GEX1具有信号肽,且信号肽的剪切位点位于第19和第20号氨基酸之间,具有3个跨膜螺旋结构,进化树显示HbGEX1与木薯(Manihot esculenta)的HbGEX1蛋白聚为一类,亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,HbGEX1在巴西橡胶雄花中的表达量比较高,在不育品种中基因的表达量高于可育品种,在橡胶树雄花的3个不同发育时期(小孢子母细胞时期,四分体小孢子时期,单核花时期)中可育品种与不育品种的表达均呈...     

巴西橡胶树HbbHLH1启动子的克隆与序列分析

bHLH转录因子在高等植物生长发育、激素应答和次生代谢调节中具有重要的功能.根据巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)HbbHLH1基因设计了2个特异性反向引物,利用GenomeWalking方法从巴西橡胶树叶片基因组DNA中克隆获得了HbbHLH1基因起始密码子上游819 bp的调控片段.序列分析表明,该片段除了含有一个典型的真核生物核心启动子区域(-60～-10bp)外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与激素和胁迫诱导相关的顺式调控元件,其中在-290 bp和-309 bp位点分别有一个应答MeJA信号反应的调控元件,但没有发现典型的乙烯响应元件.这暗示了HbbHLH1转录因子可能在橡胶树乳管分化和胶乳生物合成中具有调控作用.     

携带抗黄矮病基因染色体的分离

抗黄矮病小麦一中间堰麦草异附加系Z2 (2n=44)携带一对完整的中间僵麦草染色体,用Z2作母本与普通小麦品种中8601杂交,获得杂种F1(2n=43=21Ⅱ+1I)。利用激光显微切割技术将F1花粉母细胞减数分裂中期I及后期I的呈单价体的中间僵麦草染色体分离出来,经去蛋白、Sau3AI酶切后,进行PCR体外扩增。结果表明利用激光显微切割可分离     

巴西橡胶树HbTCTP基因的克隆及表达

在先前的研究中通过抑制缩减杂交获得了一个在巴西橡胶幼态无性系与老态无性系胶乳中差异表达的片段(HbSSHl2),BlastX分析表明,由该片段编码的氨基酸与麻疯树(Jatropha curcas L.)翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)的同源性达到92%.本研究根据HbSSHl2的序列信息设计引物,通过3L-RACE的方法获得了一个长832bp的cDNA(命名为HbTCVP),序列分析表明HbTCTP有507 bp的阅读框,68 bp的5'-UTR和255 bp的3'UTR,编码168个氨基酸,该氨基酸序列与麻疯树、油棕、花生、南瓜、番茄和拟南芥的TCTP同源性分别达到93.45%、90.48%、89.29%、85.12%、82.74%和79.76%.RT-PCR表明,HbTCTP在巴两橡胶叶片、胶乳及树皮中都有表达,乙烯利处理可诱导HbTCTP的表达,割胶抑制HbTCTP的表达,表明HbTCTP可能参与伤信号或乙烯信号传导.HbTCTP的表达分析有助于解析橡胶树幼态无性系高产的分子机制.     

橡胶树Ago蛋白基因家族分析

Ago蛋白基因家族成员与不同的小RNA结合,广泛参与细胞的生长发育及抵抗外源DNA的入侵。对Ago蛋白基因家族成员的研究有利于进一步了解各成员的功能,同时有助研究小RNA的功能。橡胶树的Ago蛋白基因家族及小RNA的研究均较少,为了弄清楚橡胶树Ago蛋白基因家族成员情况及其初步功能,本研究对橡胶树(Hevea brasiliensis)所有蛋白质序列进行了分析。用HMMER及BLAST等软件分析发现橡胶树有18个Ago蛋白,这些Ago蛋白进行分类及理化性质分析,发现其可分为3类,大多数Ago蛋白定位于细胞核,蛋白序列长度在577 aa至1 237 aa氨基酸之间,等电点在8.66至9.47间。通过qPCR技术研究橡胶树Ago蛋白的表达,发现18个Ago蛋白在不同叶龄间有差异,在白粉病菌对橡胶树进行感染处理后各Ago蛋白的表达也有差异,说明不同的Ago蛋白参与了不同的生理过程。这些结果为进一步研究各Ago蛋白在橡胶树的生长发育及抗病抗逆过程中的功能提供了理论依据。     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

巴西橡胶树产排胶机理的研究进展

天然橡胶是一种重要的战略性资源,巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Mull.Arg.)是天然橡胶的主要来源。由于巴西橡胶树是高大乔木,传统育种周期特别长,基因组测序还未完成,橡胶转基因技术尚未成熟,导致橡胶突变体不易获得,这些问题较大限制了橡胶的基础研究。尽管如此,橡胶产排胶研究近年来还是取得了一定进展。本文回顾模式植物拟南芥茉莉酸和乙烯信号途径研究的最新进展,并对其进行归纳总结,概括橡胶产排胶机制研究的进展,分析当前面临的理论和技术瓶颈,并对今后研究前景做了展望。     

巴西橡胶树伤害诱导蛋白基因的克隆及表达分析

为了研究橡胶树在逆境胁迫下的分子机制,根据巴西橡胶树抑制消减(SSH)文库和NCBI数据库中的伤害诱导蛋白基因拼接序列设计嵌套引物,通过RACE技术获得基因的完整开放阅读框,命名为HbWUN1。序列分析表明HbWUN1长872 bp,含有390 bp的开放阅读框,编码129个氨基酸。生物信息学分析结果表明HbWUN1不含信号肽和跨膜结构,为亲水性蛋白。进化分析结果显示,橡胶树HbWUN1与拟南芥NP_974279.1聚成一类。RT-PCR分析结果表明HbWUN1表达无组织特异性,在胶乳中表达量最高。在叶片不同发育时期HbWUN1表达存在变化,在衰老期最高。此外,低温、伤害、高盐、乙烯和茉莉酸处理均调控HbWUN1表达,推测其可能在橡胶树逆境反应中发挥作用。     

巴西橡胶树幼叶和成熟叶比较蛋白质组学初步研究

为研究不同发育时期橡胶树叶片的功能代谢及揭示天然橡胶胶乳的合成调控机制,本研究以巴西橡胶树古铜期幼嫩叶片（幼叶）和稳定期完全成熟叶片（成熟叶）为实验材料,提取蛋白并进行双向电泳分离,结果发现幼叶与成熟叶相比,蛋白表达图谱差异显著,鉴定出的已知蛋白中多数参与了碳代谢及蛋白的翻译后修饰功能。本研究建立了成熟的巴西橡胶树叶片比较蛋白质组学研究的技术体系,获得了高分辨率的叶片蛋白双向电泳参考图谱,鉴定出来的腈裂解酶A链,核酮糖1,5-二磷酸羧化酶和肌动蛋白等在幼叶和成熟叶片中的表达量不同,这些结果为进一步揭示天然橡胶合成调控机制提供了一定的技术支撑与实验数据,对天然橡胶合成机制的研究以及其它热带植物叶片的蛋白质组学研究具有一定的参考意义。     

根癌农杆菌介导的橡胶树花药愈伤组织遗传转化体系的建立

为建立根癌农杆菌介导的橡胶树遗传转化体系,以花药愈伤组织为受体,研究了农杆菌菌株、共培养温度、共培养时间、乙酰丁香酮(AS)等因素对遗传转化效率的影响。结果表明,农杆菌菌株、共培养温度和共培养时间对转化效率具有显著影响,AS不影响转化效率。2.2万个花药愈伤组织经EHA105菌株侵染后,转入未添加AS的培养基,22℃共培养6d,通过50mgL-1卡那霉素抗性筛选、叶片GUS染色、uidA和NptII基因PCR特异扩增、PCR产物测序及NptII基因Southern检测,鉴定出11株转基因植株,并通过嫁接和次生体胚发生,获得来自8个转基因株系的681株转基因植株,移栽成活253株。