棉花SSR多重PCR技术的初步研究和利用

简单重复序列(simple sequences repeat,SSR)具有数量丰富、高度多态、共显性等优点,是一种极具实用价值的标记,目前已成为研究种质资源遗传多样性、基因组作图的首选标记.SSR多重PCR扩增法可同时完成多个标记检测,具有高效、经济、快捷的特点,并保持了单一SSR引物扩增的高度敏感性和准确性.本文选取6对SSR引物,配成三组SSR两重PCR反应,并设置五种不同反应体系以探索PCR反应体系对其影响,以单一引物PCR扩增为对照,对用于构建亚洲棉(Gossypium arboreum)遗传图谱所用的亲本、F1及F2群体单株的DNA模板进行多重PCR探索、分析;另外,在扩增产物的电泳检测时,结合银染技术,试验了单一引物PCR扩增产物在同一泳道同时上样和先后分时上样的两重检测的方法,以期对这种方法进行多态性位点检测的效果进行评价.结果表明,即使采用与单一引物PCR相同的反应体系,两重PCR扩增也可获得与之相同的多态性产物;而两重检测法的结果亦显示出与相应的单引物检测到的相应的多态性位点,能准确反映单引物所能达到的检测效果,因而为SSR的多重PCR和扩增后多重检测的技术在高效的遗传图谱构建工作中进一步应用提供实验依据.     

玉米简易多重SSR-PCR和荧光标记检测技术

玉米是世界重要的粮食和饲料作物,通过深入研究玉米分子育种技术来提高玉米产量显得尤为必要。为了获得快速、高效的玉米DNA分子标记检测技术,本研究以玉米为试验材料,开发出一套简易、快捷的多重SSR-PCR技术和荧光标记检测方法。结果表明:2次SSR-PCR反应和1次毛细管电泳荧光检测,可以鉴定11对二等位基因多态引物,扩增方面与常规PCR反应相比效率提高了5.5倍,基因型检测方面与常规聚丙烯凝胶电泳相比效率提高11倍。利用扩增试剂盒(Mutiplex)的多重PCR扩增方法简单、稳定,取得了比较理想的玉米SSR快速高效的标记检测效果,适于在不同实验室移植。     

药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

郁金香SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立郁金香SSR-PCR反应体系,本研究以36个荷兰引进的郁金香栽培品种和5个产于中国新疆的野生种为试验材料,采用单因素试验和L_(16)(4~5)正交设计相结合的方法,对影响郁金香SSR-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA、Taq酶用量进行优化,建立最佳的SSR-PCR反应体系,并利用3对引物在41份郁金香材料中验证反应体系的稳定性。结果表明:在20μL的PCR反应体系中,10×PCR Buffer (Mg~(2+)free) 2μL、Mg~(2+)2.0 mmol/L、dNTPs 0.75 mmol/L、引物2.0μmol/L、模板DNA 10 ng、Taq酶0.15 U为最优体系;通过正交试验确定5个因子对SSR-PCR体系的影响程度为:模板DNATaq酶引物Mg~(2+)d NTPs。筛选出的3对引物在41份郁金香材料中均可扩增出目的条带,表明该体系的稳定性好。本研究建立SSR-PCR反应体系,为郁金香SSR标记的开发以及遗传多样性分析、品种指纹图谱构建、种质资源鉴定等方面提供了帮助。     

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

以大豆(Glycine max L.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量.以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响.大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0 μL 10×PCR Buffer,30 ng模板DNA,150μmol/L dNTP,0.4 μmol/LSSR引物,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0 mmoL/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性5 min.94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min,4℃保存.同时选用200对大豆引物对2份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物74对,用于大豆SSR标记的进一步研究.     

番茄叶片DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为了进一步开发利用番茄种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用高通量组织研磨机研磨微量叶片,通过改良CTAB法快速提取DNA,并利用L16(45)正交设计试验,综合采用直观量化分析和方差分析两种方法,分析Mg2+、d NTPs、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA浓度5个因素对番茄SSR-PCR扩增的影响,比较不同处理组合扩增效果的差异,最终筛选与验证最优的番茄SSR-PCR反应体系,并在此体系下对SSR引物进行筛选。结果表明番茄SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为Mg2+3.0 mmol/L、d NTPs 0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、引物0.5μmol/L、模板DNA 40 ng;且利用优化后的反应体系,从540对SSR引物中筛选出373对(占69.07%)扩增条带清晰、多态性丰富的引物。该SSR-PCR体系的建立为番茄种质资源遗传多样性分析,品种鉴定及指纹图谱构建等研究提供了一个标准化的程序。     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

凤仙花属植物SSR-PCR反应体系的建立与优化

SSR-PCR反应体系的建立与优化是凤仙花属植物(Impatiens L.) SSR标记研究的基础,本研究以8种凤仙花属植物为试材,对Mg~(2+)、Taq酶、dNTPs浓度、DNA模板、引物浓度等5因素进行L_(16)(4~5)正交试验,探讨适合凤仙花属植物的SSR-PCR反应体系,并对主要因素进行优化。结果表明:Mg~(2+)、Taq酶和dNTPs浓度3个因素对凤仙花属SSR-PCR扩增结果有显著影响,影响程度为Mg2+Taq酶dNTPs浓度DNA模板引物浓度;20μL为最佳反应体系,其中,2.6 mmol/L (含10×PCR Buffer)的Mg~(2+),1.6 mmol/L的dNTPs,2μmol/L的引物,60 ng的DNA,0.1 U的Taq酶,ddH_2O补齐剩余部分。利用优化后的反应体系对同属54种材料进行PCR扩增,扩增产物在130～200 bp,具4个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系的建立可为今后利用SSR标记对凤仙花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

香菇SSR-PCR技术体系的建立及其在遗传多样性分析中的初步应用

摘 要: 利用ISSR-抑制PCR法结合Primer 3软件开发香菇特异性的SSR引物,并采用L16（45）正交试验设计,对影响香菇SSR-PCR的主要因素进行了优化筛选,建立了最佳的SSR-PCR反应体系。在20μl反应体系中,包含1.5mmol/L Mg2+,75ng模板DNA,0.25mmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物及1.5U Taq酶。梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度为62℃。以该体系为基础,应用5对引物扩增8个香菇菌株的基因组DNA,均能获得理想结果,聚类分析结果能较好地反映供试菌株的地理来源关系。以0.5 的相似性为分割点,8个菌株可分成2大类群。类群Ⅰ主要由北方菌株组成,类群Ⅱ由南方菌株组成。     

银缕梅SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为有效利用SSR-PCR技术分析国家一级重点保护植物银缕梅的遗传多样性,采用正交试验设计L16(43),即3因素4水平,对影响SSR-PCR扩增结果的因素(引物,模板DNA浓度和循环数)进行优化筛选,并在此基础上对聚丙烯酰胺凝胶上样量进行优化,建立了适合银缕梅的最佳SSR-PCR反应体系:10μL 2×PCR Mix、40 ng模板DNA、10μmol/L引物,其余用dd H_2O补齐至20μL。PCR扩增程序为:95℃预变性15 min,95℃变性30 s,57.5℃退火1.5 min,72℃延伸1 min,30个循环,循环结束后,60℃延伸30 min,扩增产物4℃保存。聚丙烯酰胺凝胶电泳上样量以1.5~2.0μL为最佳。利用优化后体系进行引物筛选,从18对引物中筛选出11对具有多态性引物,说明该反应体系具有良好的稳定性。该体系的建立可以为今后利用SSR标记对银缕梅遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供基础。     

苹果SSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立苹果属植物SSR-PCR反应优化体系,采用L16(45)正交实验和退火温度梯度实验,分析反应体系中使用的模板、引物、Mg2+、dNTPs以及Top Taq酶浓度对扩增产物的影响,并对这5个因素进行4个水平不同浓度梯度的筛选和优化.结果表明,引物浓度对SSR-PCR反应体系的影响最大,通过综合分析最终确定SSR-P...     

国产糖甜菜品种SSR指纹图谱的构建

为了构建14份国产甜菜品种的指纹图谱,利用6个差异较大的甜菜品系对50对SSR引物进行筛选,共选出7对多态性高、带型清晰、重复性好的SSR引物。利用这7对SSR引物对国产14份糖甜菜品种进行扩增,共获得40条谱带,其中多态性位点28个,多态性比率达75%;每对引物产生的等位基因数为5-8个,平均6.6个。利用其中三对引物S6,S13和BVGTT6构建了14份国产甜菜品种的DNA指纹图谱,结果表明,每个甜菜品种有唯一的数字指纹区别于其它品种,说明SSR标记适用于甜菜品种纯度和真实性的鉴定,同时甜菜品种指纹图谱库的构建也为将来可能出现的甜菜品种纠纷打下坚实的技术基础。     

甜菜TRAP-PCR反应体系的建立及引物开发策略

以糖用甜菜为材料,利用单因素实验探讨甜菜TRAP-PCR反应体系中dNTPs、引物、模板以及DNA聚合酶等4个因素的浓度变化对扩增结果的影响,最终建立糖用甜菜的最佳TRAP-PCR反应体系。结果表明,在20 μL反应体系中,甜菜TRAP-PCR最优反应体系包含2.0 μL的10×PCR buffer（含Mg²⁺）、10 ng的模板DNA、0.75 U的Taqase、10 μmol/L固定引物及随机引物各0.8 μL以及0.5 μL的dNTPs (2.5 mmol/L each)。并建立了一种快速开发甜菜TRAP-PCR引物的方法,利用优化后的程序对15份糖甜菜品种进行扩增。结果表明,该体系扩增结果稳定、条带清晰,部分引物多态性丰富,可用于糖用甜菜品种指纹图谱的构建以及其他分子生物学领域的研究。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。     

利用PCR仪快速提取甜菜基因组DNA

为了寻找一种快速提取甜菜基因组DNA的方法,以甜菜干种子、幼苗、种仁以及甜菜叶片干粉为原料,利用PCR仪结合碱裂解法快速提取甜菜基因组DNA,利用微量分光光度计检测取DNA的浓度,并用甜菜SSR引物对提取的DNA进行扩增。结果表明,在4 种材料中均检测到了DNA,干种子、幼苗、种仁以及叶片干粉中提取的DNA平均浓度分别为432、197、158、448 ng/μL,无论是DNA原液还是稀释到20 ng/μL的工作液,均能在SSR-PCR反应中扩增出清晰的条带。该方法提取甜菜基因组DNA简单、快速,仅需要NaOH和HCl两种药品,提取的DNA完全可以用于SSR-PCR反应,为快速鉴定甜菜品种纯度和真实性提供了技术支持。     

适于甜菜品种鉴定的SSR核心引物的筛选

为了筛选出适合于甜菜杂交种鉴定的核心引物,以16个在中国种植面积较大的进口甜菜品种为材料,对已公布的130对甜菜SSR引物以及70对甜菜EST-SSR引物进行筛选。结果从200对甜菜SSR引物中筛选出了24对扩增条带清晰、重复性好且多态性高的核心引物。这24对引物中有22对引物的PIC值大于0.5,其中7对引物的PIC值均大于0.8,可以作为甜菜品种鉴定的首选核心引物。利用筛选出的核心引物对16个甜菜品种进行聚类分析,结果16个品种分为3类,基本上是同一公司的品种聚在了一起。甜菜SSR核心引物的筛选将大大加速甜菜品种纯度和真实性鉴定的速度,也将更快的促进甜菜分子生物学其他领域的发展。     

甜菜全基因组SSR引物的筛选与评价

旨在筛选出适合于甜菜分子生物学实验的SSR核心引物,为后续构建甜菜指纹图谱及遗传多样性分析奠定重要基础。本文利用4种不同的甜菜种质资源和4个不同的甜菜品种,对基于甜菜全基因组编码区序列设计的247对SSR引物进行了初步筛选。结果表明,247对引物中绝大多数引物没有多态性或者多态性不好,只有27对引物具有较高的多态性,这27对引物总共扩增出103条带,其中多态性条带95条,多态性比率为90.43%。这些引物多态性信息量(PIC)范围为0.549~0.983,平均每一对引物的PIC值为0.841。试验结果表明虽然经过了电子PCR的筛选,想要找到合适的甜菜SSR引物依然比较困难,说明甜菜的遗传基础比较狭窄。这27对SSR引物适用于甜菜分子标记,为甜菜品种标准化鉴定体系的大规模构建和应用奠定了重要基础。     

白蜡属SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究建立了适合白蜡SSR-PCR反应的最佳体系,并利用该体系从50对白蜡引物中筛选出了3对条带清晰、多态性好的引物,用于白蜡SSR标记的进一步研究。该研究采用L₁₆(4⁵正交设计和单因素试验对影响白蜡SSR-PCR的Taq聚合酶用量、Mg²⁺浓度、DNA模板浓度、dNTP浓度和引物浓度等5个因素在4水平上进行筛选。优化后的白蜡SSR反应体系为：Mg²⁺ (25 mmol/L) 0.8μL、引物(10μmol/L) 0.2μL、DNTP (10 mmol/L) 0.3μL、Taq酶(5 U/μL) 0.05μL、DNA模板(5~10 ng/μL) 2.00μL、10×PCR缓冲液1.0μL,ddH2O 5.45μL,总体积10.0μL。该结果为今后利用SSR-PCR标记技术研究分析白蜡奠定了基础。     

3种PCR程序扩增甜菜SSR及InDel标记的比较

本研究旨在扩增出条带清晰、非特异性条带少的SSR/InDel标记产物。选择来自6个国家的12份不同基因型甜菜品种,利用SSR及InDel两种标记方法,Touch-down PCR、梯度PCR及常规固定退火温度PCR三种反应程序扩增产物。通过比较扩增产物的多态性、稳定性、清晰度选择适合两种分子标记方法的PCR反应程序。结果表明:Touch-down PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出带型清晰,无无效带,扩增效果稳定的样本产物。梯度PCR法扩增结果不稳定,有非特异性条带出现并且弥散现象严重。固定退火温度PCR扩增结果因引物不同而差异较大,同时伴有弥散现象。Touch-down PCR扩增产物特异性,稳定性均高于梯度PCR及固定退火温度PCR,且较梯度PCR法省略了摸索最适退火温度的过程。因此,推荐使用Touch-down PCR程序进行甜菜SSR与InDel分子标记法研究。