鸭茅SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

应用L16(44)正交设计对影响鸭茅SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于鸭茅的SSR反应体系和扩增程序.在15μL体系中各反应的最适合含量为:50ng模板DNA,240μmol/L dNTP,0.4μmol/L SSR引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,1.5μL 10×PCR Buffer,2.5mmol/L MgC12.PCR适宜扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性30 s,52℃复性30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸10 min,4℃保存.并对引物最适合退火温度进行优化,最终确定引物退火温度为48～52℃.同时选用100对鸭茅引物对4份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物30对.用于鸭茅SSR标记的进一步研究.     

元宝枫SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

本研究采用改良的CTAB法提取元宝枫基因组DNA,并使用L16(45)正交试验设计.通过5因素4水平实验,筛选Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物浓度、Mg2+、模板DNA浓度及其用量,建立并优化元宝枫(Acer truncatum)的最佳SSR-PCR反应体系,即总体积20 μL,Taq DNA聚合酶、dNTPs...     

药用菊花SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为进一步开发利用药用菊花种质资源和开展分子标记辅助选择育种,本研究利用L25(56)正交设计对影响药用菊花SSR-PCR反应的模板DNA、Mg2+、d NTPs、Taq酶、引物等5个因素进行优化,并对SSR引物进行筛选。结果建立了药用菊花SSR-PCR最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng,正、反向引物0.25μmol/L,d NTPs 0.3 mmol/L,Mg2+3.0 mmol/L,Taq酶1.5 U。运用优化后的反应体系,从136对引物中成功筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的SSR引物57对,大多数条带大小集中在100~500 bp,不同引物扩增的条带数为5~15条。优化的SSR-PCR反应体系在多个药用菊花品种遗传多样性研究中得到了验证,获得了稳定性、重复性良好和多态性丰富的扩增图谱。该体系的建立可为今后利用SSR标记对药用菊花种质鉴定、遗传多样性分析、系统发育研究、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助育种等研究提供了依据。     

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。结果表明各因素的终浓度分别在Mg²⁺浓度2.5 mmol/L、dNTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4 μmol/L及退火温度为53.9℃时最为适合。通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。     

二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合二月兰的SSR-PCR反应体系,采用正交试验设计方法对影响二月兰SSR反应体系的5个因素(DNA模板、Mg~(2+)、d NTPs、引物和Taq聚合酶)进行优化试验,筛选出每个因素的最佳水平。结果表明,10μL反应体系中,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,d NTPs浓度0.4 mmol/L,引物浓度0.6μmol/L,DNA模板量20 ng,Taq聚合酶量0.6 U。以3份二月兰基因组DNA为模板,利用优化后的SSR-PCR反应体系进行引物筛选,从50对SSR引物中成功筛选出扩增条带清晰、具有多态性的引物有12对,证明该反应体系具有较好的稳定性和通用性。研究建立和优化的二月兰SSR-PCR反应体系,为进一步利用SSR标记技术开展二月兰分子生物学研究提供了理论依据和技术参考。     

冬瓜SSR-PCR体系优化及引物筛选

本研究利用L16(54)正交试验设计研究了影响冬瓜SSR-PCR的五个因子(10×Buffer(含Mg2+),d NTP,DNA,引物,r Taq),研究结果表明Buffer(含Mg2+)和r Taq对PCR影响最明显,最终筛选出最佳反应体系:10×Buffer 2.0μL(1×Buffer),d NTP 2.0μL(200μmol/μL),DNA 0.6μL(6 ng/μL),引物0.4μL(0.2μmol/L)。体系体积为20μL,循环数为35。引物筛选程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,58℃~68℃复性30 s,5个循环,每个循环退火温度降2℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃~58℃复性1 min,8个循环,每个循环退火温度降低1℃,72℃延伸1 min,94℃变性30 s,50℃复性30 s,72℃延伸1 min,共30个循环,72℃延伸7 min。本研究建立了适合冬瓜的SSR反应体系和引物多态性筛选程序。     

正交设计优化大豆SSR-PCR反应体系及引物筛选

以大豆(Glycine max L.)为材料,研究了PCR反应体系的主要成分对大豆SSR扩增结果的影响,并确定影响SSR扩增结果的各因素的最佳用量.以CTAB法提取的大豆叶片DNA为模板,应用L16(44)正交设计对影响大豆SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适合大豆SSR-PCR反应的最佳体系.结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响.大豆SSR-PCR优化反应体系为:2.0 μL 10×PCR Buffer,30 ng模板DNA,150μmol/L dNTP,0.4 μmol/LSSR引物,1.5 U Taq DNA聚合酶,2.0 mmoL/L Mg2+,加ddH2O至终体积20.0μL.优化的PCR扩增程序为:94℃预变性5 min.94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃延伸5 min,4℃保存.同时选用200对大豆引物对2份材料进行扩增,筛选出条带清晰,多态性好的引物74对,用于大豆SSR标记的进一步研究.     

云南草果SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选

草果为药食两用的草本植物,近年来在市场上供不应求,但关于草果居群的分子鉴定及种质资源的研究极为稀少。为使云南草果产业更加健康和可持续的发展,本实验对云南草果进行了SSR-PCR反应体系的优化及引物的筛选,为研究草果遗传多样性提供了依据。实验采用L16(43)正交试验设计,对PCR反应体系中的3个因素(2×Taq PCR Starmix,引物, DNA模板)进行优化,并利用单因素分析法,对PCR退火温度、PCR扩增产物点样量进行实验与分析。最终确定5个因素的最佳水平,即DNA模板(50 ng/μL) 2μL,2×Taq PCR StartMix 6μL,正反引物(10μmol/L)各1.5μL,dd H2O补足至20μL (即加入ddH2O 9μL),PCR产物点样量可以选择在1.5～2μL之间。从48对SSR引物中筛选出了7对扩增结果好的引物。7个SSR引物可用于草果资源的遗传多样性研究,为分子技术研究提供了科学依据。     

风信子ISSR-PCR体系的优化及引物筛选

以风信子基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中Mg2+浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶的用量5个因素进行研究,建立了风信子ISSR-PCR扩增最佳反应体系,即:20μL反应体系中分别加入2μL10×Buffer、1.4μL Mg2+(25mmol/L)、1.5μL dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μL引物(10pmol/μL),0.2μLTaq酶(5U/μL),1.2μL模板(30ng/μL),ddH2O补足体积。并以此体系对110条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条。     

花生SSR-PCR体系的优化

以花生品种丰花3号为材料,研究了花生SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR 扩增效果的影响及不同引物的退火温度。结果表明dNTP 对扩增影响较大,每对引物都有其扩增适合的退火温度。确立了适合花生SSR 分子标记研究的优化体系。最终确定总反应体系为20 μl,其中25 mM MgCl2 1.5 μl,2.5 mM dNTP 1.6 μl,5 U/μl Taq 酶 0.17 μl,100 ng/μl模板DNA 0.4 μl,2.5 mM 引物 5 μl。优化后的扩增程序退火温度为54℃。     

食用向日葵SSR-PCR反应体系的优化

为建立食用向日葵分子标记反应体系,以食用向日葵四叶期叶片为DNA模板提取材料,采用单因素试验和正交试验设计,对SSR-PCR反应体系中的6因素(10×PCR Buffer、Mg2+、d NTPs、引物、Taq DNA聚合酶和DNA模板)在5水平上进行正交优化试验,并比较了不同浓度Mg2+、Taq DNA聚合酶、模板DNA对扩增效果的影响,结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响为Mg2+Taq DNA聚合酶(引物)DNA模板10×PCR Bufferd NTPs。最终建立食用向日葵SSR-PCR最佳反应体系为:在总体系为20μL的SSR-PCR反应体系中包括10×PCR Buffer 0.2mmol/L、Mg2+2.0 mmol/L、d NTPs 1.8 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.2 U、DNA 50 ng、引物1.5 mmol/L。     

马铃薯SSR-PCR反应体系的建立和优化

应用L16(45)正交设计对影响马铃薯SSR-PCR的主要参数进行优化,建立适于马铃薯SSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同水平浓度对PCR反应结果均有显著影响。马铃薯SSR-PCR优化反应体系为:10×PCR Buffer 1.0μl、模板DNA约30 ng、dNTP 200 mol/L、SSR引物66 ng、Taq DNA聚合酶0.25 U、Mg2+2.25 mmol/L,加ddH2O至终体积10.0μl。PCR扩增程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸10 min,然后4℃保存。     

石榴基因组DNA的提取及RAPD引物筛选

以山东省枣庄市峄城区中国石榴种质资源圃内石榴品种为材料,采取改良CTAB法提取石榴基因组DNA,经RAPD-PCR扩增筛选引物。结果表明：CTAB法提取的石榴基因组DNA谱带清晰,纯度高,浓度大,可以用于RAPD分析。从50条随机引物中筛选出多态性高、重复性好的多态性引物20条。20条引物对10个品种扩增结果共产生180个位点,多态性位点为134,多态性比率为74.4%。     

绣球SSR-PCR反应体系的建立与优化

为了建立适合绣球的SSR-PCR反应体系,采用正交设计L25(56)对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、d NTPs、引物、DNA模板和Taq聚合酶)在5个水平上进行优化,筛选出每个因素的最佳水平,建立适合绣球的SSR-PCR反应体系。结果表明,20μL的SSR-PCR反应体系中,DNA模板用量为60 ng,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,d NTPs浓度为0.3 mmol/L,引物浓度为0.4μmol/L,Taq聚合酶用量为0.8 U。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,最佳温度退火40 s,72℃1 min,33个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。选用10个绣球品种对建立的SSR-PCR反应体系进行验证,结果表明该体系具有较好的稳定性和通用性。建立和优化的绣球SSR-PCR反应体系,为应用SSR分子标记技术开展绣球属植物遗传育种研究提供了理论依据和技术参考。