家蚕幼虫性腺表达序列标签分析(英文)

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库.利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得 16 737条ESTs(精巢 8 407条,卵巢 8 330条),拼接这些ESTs共得到 2 107个重叠群(contig)和 3 532个单拷贝(singlet).将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性.功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在.基因本体(gene ontology)功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大.研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息.     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

家蚕vasa基因的结构及表达型研究

vasa是决定生殖系发育的重要调控蛋白因子之一,具有广泛的保守性。利用家蚕基因组和EST库的数据资源,分析了家蚕vasa基因的结构,并与已有报道的18个物种的VASA蛋白质的结构域序列进行了比对分析,同时对家蚕vasa基因在家蚕胚胎发育11个时期的表达型及幼虫期8个不同组织的表达特异性进行了验证。结果表明,家蚕vasa基因包含有13个外显子,比果蝇vasa基因的外显子数量(7个)增加了6个,在第3内含子有1个转座子插入;家蚕vasa基因在未受精卵和胚胎发育的各个时期均有表达,但只在幼虫生殖腺中有表达。将家蚕vasa基因的一条cDNA片段用地高辛标记作为探针,对家蚕幼虫的生殖腺及胚胎进行全胚原位杂交,结果进一步表明家蚕vasa基因在幼虫期只在精原细胞、精囊、卵巢管等生殖系相关的细胞和组织中表达,在发育5d胚胎的生殖腺部位也有明显表达。     

家蚕卵巢肿瘤基因Bmotu及其可变剪接

已知卵巢肿瘤基因(ovarian tumor gene,otu)在果蝇(Drosophila melanogaster)卵巢发育过程中发挥极其重要的作用,该基因突变会扰乱卵子形成的正常过程。为探究家蚕(Bombyx mori)是否具有类似果蝇生殖发育相关基因otu的同源基因,以及基因存在的可变剪接形式,在电子克隆的基础上,应用RT-PCR从家蚕精巢组织中获得了4条不同长度的Bmotu cDNA片段(GenBank登录号:HQ831341,HQ831342,HQ999998,HQ831343),其中3条由于无义突变导致翻译提前终止;而从卵巢组织中仅获得了1条Bmotu cDNA片段,该片段序列与精巢中扩增的登录号为HQ831343片段序列的5'端相同。结果表明Bmotu基因存在可变剪接,且雌、雄之间的剪接方式可能存在差异。生物信息学分析发现Bmotu基因编码蛋白与果蝇Otu的结构类似,含有半胱氨酸蛋白酶结构域(Otu结构域)、Tudor结构域、脯氨酸基序。研究结果有助于进一步探讨家蚕生殖发育机制。     

籽鹅卵巢组织差异表达基因的研究

本研究旨在筛选产蛋前期和产蛋期籽鹅卵巢组织差异表达的基因,并进行功能分析,从而探讨鹅产蛋的分子调控机理。利用抑制性消减杂交技术筛选籽鹅卵巢组织中的差异表达基因,用GOTM软件将所得ESTs从分子功能水平进行GO分类。结果表明,所构建的籽鹅卵巢组织消减cDNA文库的削减效率在20倍以上,片段大小主要在300～750bp;挑选86个阳性克隆测序,获得15个ESTs,其中有11个为已知的ESTs,4个未知的ESTs;11个已知的ESTs被分成结合功能、催化活性、酶调节活性、转运蛋白活性和其它功能。本研究成功构建了籽鹅卵巢组织消减cDNA文库,并筛选得到了15个可能在产蛋前期和产蛋期籽鹅卵巢组织中差异表达的ESTs,它们可能在鹅产蛋过程中起着重要的调控作用。     

家蚕胚胎发育相关基因的分析(英文)

在家蚕基因组中检索分析了与果蝇86个胚胎发育相关基因同源的基因。分析结果表明,在果蝇的这86个基因中,有62(72%)个基因在家蚕基因组中存在直向同源关系,其中58(67%)个基因并且在家蚕、果蝇、冈比亚按蚊3种昆虫的基因组间呈现1∶1∶1直向同源关系。通过比较分析发现,体节极性决定基因在3种昆虫基因组间最为保守。同果蝇和冈比亚按蚊相比,家蚕中决定背-腹部形成的基因分化最大。进一步利用芯片数据对其中的12个母性基因在家蚕5龄第3天幼虫生殖腺中的表达情况进行分析:有2个基因(orb和nanos)在卵巢中特异表达;4个基因(spire、Ras85D、gd和arrest)在精巢中特异表达;另外的6个基因(exuperantia、vasa、pumilio、mago nashi、nudel和dorsal)在精巢和卵巢中均有表达,但是其中的2个基因(pumilio和nudel)在雌、雄间的表达量存在显著差异。研究结果为家蚕发育调控机制的进一步研究提供了重要线索和数据信息。     

一个新的家蚕kunitz类型CI基因的克隆和序列分析

家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂(chymotrypsin inhibitor,CI)的多个编码基因位于多个染色体位点上,是家蚕CI具有丰富多态性的原因之一。根据Gene Bank中登录的家蚕CI基因Sci-sb的mRNA,设计引物克隆了一个家蚕kunitz类型的CI基因,命名为CI-fb。CI-fb基因有3个外显子,开放阅读框长度为255 bp,编码85个氨基酸残基,具有一个典型的kunitz结构域。CI-fb基因与其他已知的kunitz类型的CI基因相比,在基因序列和结构、蛋白序列和结构上高度相似,但在已知的CI基因家族中序列最短。RT-PCR分析表明,CI-fb基因在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、气管和中肠6个组织中表达,而在丝腺、血细胞和体壁中没有表达,是一个组织特异性表达的基因。研究结果为进一步研究家蚕CI的多态性和功能提供了新的线索。     

家蚕感染BmCPV相关未知功能蛋白LOC101742613的基因克隆及表征特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个表达量明显下调的未知蛋白LOC101742613,与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的未知蛋白LOC110378285的序列一致性为51%。利用PCR技术克隆获得了编码该蛋白质的cDNA,其序列全长为1 114 bp,最大开放阅读框(ORF)为993 bp,编码的蛋白质由330个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子质量为36.6 kD,等电点为4.31。实时荧光定量PCR分析发现目的基因主要在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢和头部组织中表达,且家蚕中肠感染BmCPV后48 h和72 h其mRNA的表达量显著下调,分别为对照组的7.3%和2.1%。通过构建重组表达载体pET28a/BGIBMGA014203对去掉信号肽的目的蛋白进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白主要在包涵体中,分子质量约为37 kD。研究结果为进一步阐明目的基因的生物学功能奠定了基础。     

籽鹅卵巢组织中铁蛋白重链基因和8个新ESTs的定量研究

采用实时定量PCR技术定量检测产蛋前期和产蛋期籽鹅卵巢组织中铁蛋白重链基因(FTH)和8个新ESTs(ODEUG01~ODEUG08)的mRNA表达水平。结果表明:产蛋期籽鹅卵巢组织中FTH和8个新ESTs的相对表达量分别比产蛋前期卵巢组织高13.25、7.68、11.82、14.23、8.25、15.14、9.78、6.48、14.21倍。本研究进一步证实,FTH和8个新ESTs在产蛋期籽鹅卵巢组织中高效表达,FTH和8个新ESTs可能参与籽鹅卵巢功能的调节,并影响籽鹅的产蛋性能。     

家蚕和野桑蚕酚氧化酶原基因的组织表达差异比较

酚氧化酶在昆虫体液免疫反应中起着非常重要的作用。根据GenBank中登录的家蚕和野桑蚕酚氧化酶原基因cDNA序列设计特异引物,用半定量RT-PCR方法检测了家蚕和野桑蚕各组织中酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的表达谱,发现该基因在家蚕和野桑蚕组织中的表达差异较大,且具有明显的组织特异性。家蚕PPO1基因只在血液中被检出有很高的表达,而野桑蚕PPO1基因在血液和头部中均有表达,且在血液中的表达量最高;PPO2基因在家蚕组织中的表达量从高至低顺序为血液、脂肪体、卵巢、头部、表皮、精巢、中肠和丝腺,而在野桑蚕组织中的表达量从高至低顺序为血液、头部、中肠、表皮、精巢、卵巢和脂肪体,在丝腺中没有被检出有表达。推测可能是由于起源于野桑蚕的家蚕在长期的驯化及人工选择过程中引起了酚氧化酶原基因功能的变化。     

猪TIMP-2基因克隆、序列特征和表达分析

本研究分析了五指山试验用小型猪TIMP-2基因的分子特性和可能的生物学功能.将人TIMP-2 mR-NA全长序列在猪ESTs数据库中检索获得同源性较高的ESTs,用电子克隆结合RT-PCR方法克隆获得包含完整CDS区的猪TIMP-2基因cDNA序列,应用生物信息学方法分析了其核苷酸序列及其编码蛋白质分子结构特性,应用RT-PCR研究该基因在猪不同组织和发育时期的特异表达情况.结果,猪TIMP-2 cDNA序列全长790 bp,包括663 bp的完整开放阅读框,编码221个氨基酸.多序列比对和系统进化分析表明,该基因编码蛋白质与人(97%)、大鼠(97%)、小鼠(97%)等物种TIMP-2蛋白质具有较高的同源性.蛋白质序列预测分析发现,猪TIMP-2氨基酸序列理论等电点(pI)为7.65,相对分子质量(MW)为24.5 ku,它包括27AA的前导序列和194AA的成熟肽段,其前导序列比其它物种多1个亮氨酸(Leu).结构功能预测发现其具有1个在种间高度保守的NTR_TIMP结构域和N端VIRAK保守序列,序列中存在的12个半胱氨酸(Cys)可以形成6对二硫键结构.表达谱分析表明TIMP-2基因在猪的多个组织和不同发育时期的表达量存在较大差异,在睾丸、垂体、胃、大肠、卵巢、子宫和90 d胚胎骨骼肌中高表达;而在心脏、小肠、脑、肝脏、成年猪骨骼肌中表达量极低;在肾脏、胸腺、脾、甲状腺、33 d胚胎中中度表达.结果表明该基因在发生组织发育和重构活动相对活跃的组织器官和时期表达水平较高,亦符合其固有生物学功能.     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕异时性基因Bmlin-28的克隆及表达研究

本文通过对其他物种中相关基因的同源比对,首次在家蚕中鉴定了异时性基因Bmlin-28,并对其时空表达模式进行了分析。Bmlin-28在家蚕大造品种5龄3d的卵巢、精巢、血液中特异表达,其中在卵巢中的表达量最高;在3龄前期的表达量要高于3龄后期。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。     

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。     

家蚕B型清道夫受体基因的鉴定及系统发生与表达分析

B型清道夫受体(SR-B)是清道夫受体超基因家族成员,参与机体的脂类代谢、动脉粥样硬化形成或保护、宿主免疫损害防御、凋亡细胞清除和细胞粘附等重要生命过程。基于家蚕全基因组数据,利用比较基因组学方法,鉴定获得了14个家蚕B型清道夫受体基因,这些基因分布在至少5条染色体上,其内含子的大小从几十到近万个碱基对。系统发生分析表明,14个家蚕B型清道夫受体基因分布在3个类群:第1类群中分布的9个基因和第3类群中分布的3个基因,分别与类群中其它昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系;第2类群中分布有2个基因,此类群中不同昆虫的同源基因之间的进化关系较为复杂。EST数据和芯片数据分析表明,多数家蚕B型清道夫受体基因具有转录活性。RT-PCR检测结果显示,有8个家蚕B型清道夫受体基因在5龄第3天幼虫组织中表达,并具有不同的表达模式,推测这些基因可能行使不同的功能。研究结果为进一步诠释家蚕B型清道夫受体基因的功能奠定了基础。     

miR-143在尼罗罗非鱼性腺组织中的表达和功能预测

miR-143是一种广泛表达的miRNA,本研究采用RT-qPCR方法检测miR-143在尼罗罗非鱼雌雄性腺中的表达差异,同时对它的靶基因进行预测,并对靶基因进行GO富集和KEGGpathway分析。结果表明:miR-143在尼罗罗非鱼雌雄性腺均有表达,在卵巢中表达量显著高于精巢(P0.05);GO富集分析表明,miR-143参与细胞增生、营养积累和代谢等多个生物学过程;KEGGpathway分析表明,IGF1R、CAMKⅡ和PLA2等靶基因富集于与性腺发育、繁殖相关的卵母细胞减数分裂通路、Wnt信号通路和GnRH通路。本研究为探究miR-143在鱼类性腺发育过程的功能和分子机理提供了基础资料。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

基于相对和绝对定量同位素标记技术分析2种成熟度桑叶对家蚕脂肪体蛋白质组的影响

本试验旨在探索家蚕体适应桑叶营养物质变动的微观机制。首先检测老、嫩2种成熟度桑叶的水分、粗蛋白质、粗脂肪、可溶性糖、还原性糖、多糖、总黄酮、总多酚和1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）含量,然后采用相对和绝对定量同位素标记（iTRAQ）技术分析由这2种桑叶饲喂3 d的5龄家蚕脂肪体蛋白质组表达谱,并对差异表达蛋白进行生物信息学分析。结果显示：嫩桑叶的粗蛋白质、粗脂肪、还原性糖、总黄酮、总多酚、1-DNJ含量极显著高于老桑叶（P<0.01）。iTRAQ定量分析共鉴定到家蚕脂肪体蛋白2 172个,2组间差异表达蛋白173个。相对于摄食老桑叶的家蚕,摄食嫩桑叶的家蚕脂肪体中上调表达蛋白为85个,下调表达蛋白为88个。对其中的111个差异表达蛋白[差异表达倍数（FC）>1.25或<0.80]的功能富集分析发现,GO和KEGG通路注释到这些蛋白主要参与物质代谢、运输和贮存,应激和免疫反应,机体发育等生物学过程。差异表达蛋白互作网络分析筛选到核糖体蛋白和神经前体细胞表达发育下调蛋白8(NEDD8)的网络中心性高。综上可知,桑叶成熟度显著影响其营养物质含量,引起摄食老、嫩桑叶家蚕脂肪体蛋...     

梅山与杜洛克母猪发情前期卵巢组织差异表达基因的分离与鉴定

为了探讨梅山与杜洛克母猪卵巢差异表达基因对猪排卵与繁殖性状的影响,应用mRNA差异显示技术研究梅山猪与杜洛克猪卵巢中基因表达的差异性,分离9条在纯种梅山猪与纯种杜洛克猪卵巢中差异表达的表达序列标签(ESTs),并用半定量RT-PCR鉴定。通过BLAST比对发现,其中有3条EST与GenBank序列同源性较高。组织表达谱分析揭示了这些ESTs在梅山猪心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、小肠、大脑、卵巢、子宫、脾脏、输卵管等各个组织中的表达有不同程度的差异。研究结果表明,梅山猪和杜洛克猪卵巢之间的不同基因差异表达的方向存在差异,这些差异表达的基因可能在某种程度上导致猪繁殖力的差异,进而为研究影响猪排卵数的分子机理调控网络打下基础。