Chicken lung lectin is a functional C-type lectin and inhibits haemagglutination by influenza A virus

Many proteins of the calcium-dependent (C-type) lectin family have been shown to play an important role in innate immunity. They can bind to a broad range of carbohydrates, which enables them to interact with ligands present on the surface of micro-organisms. We previously reported the finding of a new putative chicken lectin, which was predominantly localized to the respiratory tract, and thus termed chicken lung lectin (cLL). In order to investigate the biochemical and biophysical properties of cLL, the recombinant protein was expressed, affinity purified and characterized. Recombinant cLL was expressed as four differently sized peptides, which is most likely due to post-translational modification. Crosslinking of the protein led to the formation of two high-molecular weight products, indicating that cLL forms trimeric and possibly even multimeric subunits. cLL was shown to have lectin activity, preferentially binding to alpha-mannose in a calcium-dependent manner. Furthermore, cLL was shown to inhibit the haemagglutination-activity of human isolates of influenza A virus, subtype H3N2 and H1N1. These result show that cLL is a true C-type lectin with a very distinct sugar specificity, and that this chicken lectin could play an important role in innate immunity.     

牛肌肉生成抑制素基因功能区的克隆与原核表达

根据GenBank中牛肌肉生成抑制素（MSTN）基因序列设计了1对引物，在引物两端分别加EcoRⅠ和XhoⅠ识别位点。利用RT—PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体，酶切、PCR鉴定及测序分析表明，该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌，经IPTG诱导，牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。     

牛脂联素基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

应用RT-PCR方法扩增牛脂联素(Bovine adiponectin,BovADPN)基因,连接到载体pMD18-T中;测序并利用BLAST工具对比证明该基因序列正确,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段,并将其定向克隆到pPICZαA载体中,构建重组质粒pPICZαA-BovADPN.用Sac Ⅰ酶切使其线性化,以化学方法(LiCl)转化入感受态毕赤酵母细胞GS115;重组子经高质量浓度Zeocin(1 000 mg/L)筛选、MDH/MMH平板筛选、PCR鉴定后,用1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE及Western-blot分析.结果表明,所获得的酵母重组子能够分泌表达出相对分子质量为40 000的重组蛋白.     

牛新孢子虫NcSRS2基因腺病毒穿梭载体的构建及在293细胞中的表达

应用PCR技术扩增牛新孢子虫NcSRS2基因,纯化PCR产物后与克隆载体pMD18-T Simple Vector连接,将PCR、酶切鉴定及测序分析正确的pMD-18T-NcSRS2重组质粒进行EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,克隆至相同酶切回收后的腺病毒穿梭载体pCR259中,再将PCR、酶切鉴定正确的pCR259-NcSRS2重组质粒转染293细胞,应用IF-AT和Western-blotting技术检测重组质粒在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的牛新孢子虫NcSRS2基因长度为1 227bp,与GenBank中发表的NcSRS2（AF061249）核苷酸序列同源性为99%,构建的pCR259-NcSRS2重组质粒在293细胞中得到瞬时表达,表达蛋白的相对分子质量为43 000,具有较好的反应原性。本试验为新孢子虫病腺病毒载体疫苗的构建奠定了基础。     

牛脂联素基因真核表达载体的构建及鉴定

为了构建牛脂联素基因真核表达载体,试验采用RT-PCR方法扩增牛脂联素(bovine adi-ponectin,BovADPN)基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测序正确的质粒经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,回收目的基因片段将其定向克隆到pPICZαtA载体中,构建重组质粒pPICZαA BovADPN.结果表明:克隆的基因序列与GenBank公布的序列有100%的同源性;目的基因正向插入,阅读框正确无误,说明牛脂联素基因真核表达载体构建成功.     

布氏锥虫C型凝集素类似蛋白的鉴定

C型凝集素在机体免疫系统中具有重要的作用.为了解布氏锥虫(T.brucei)基因组编码的C型凝集素类似蛋白(CLLPs),本研究在GeneDB数据库中通过软件鉴定了13种T.brucei基因组编码的CLLPs家族基因序列,并分析它们之间的遗传进化关系.同时,采用RT-PCR方法检测了其中3种CLLPs基因在血液阶段(BSF)T.brucei虫体内的转录.利用PCR扩增并在大肠杆菌中对所选3种基因进行表达,以表达的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.实验结果表明,本研究选择的3种CLLPs基因在BSF T.brucei虫体内均能够进行转录;而通过间接免疫荧光检测表明所选的3种CLLPs基因中,只有一种CLLP (Tb5290)在T.brucei的BSF阶段和昆虫阶段(PCF)表达.本研究首次在T.brucei中鉴定了C型凝集素家族的新成员,为进一步了解CLLPs在T.brucei中的生物学功能的研究奠定了基础.     

牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析

为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD 18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和westem blot分析表达产物.结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7％;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性.本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础.     

Cytotoxic capabilities of bovine lymphocytes after lectin stimulation

Bovine peripheral blood mononuclear leukocytes (PBML) were stimulated in vitro with the mitogenic lectins concanavalin A (Con A) and phytohemagglutinin. Their cytotoxic capabilities were evaluated in a 51Cr release assay. Lectin-activated bovine effector cells did not mediate antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) nor direct killing against cultured tumor target cells. Nevertheless, activation of PBML with lectins consistently generated effector cells able to mediate lectin-dependent cellular cytotoxicity. Cultivation of Con A stimulated-PBML for 3 to 4 weeks in the presence of lymphokines-containing IL-2 generated cells with the ability to mediate lysis without using Con A-coated target cells. However, cytotoxic cultures capable of mediating direct lysis of target cells were not able to mediate ADCC.     

牛朊蛋白27-30基因的克隆与表达

利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。     

瑟氏泰勒虫p33基因与牛IL-18基因的串联表达

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。     

牛白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,主要由激活的T淋巴细胞产生,它能提高免疫细胞杀伤癌细胞、病毒或细菌感染细胞以及促进抗体生成和分泌的能力[1-2],在机体正常免疫过程中起着十分重要的作用.     

牛瑟氏泰勒虫MPSP双表位基因的克隆及原核表达

为了探究表位疫苗是否可以应用于预防牛瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti),根据MPSP (Major piroplasm surface protein)基因序列(FJ515689.1)设计合成了2对引物,以T.sergenti基因组DNA为模板,通过SOE-PCR扩增出长约361 bp的双表位基因融合片段,2个表位基因通过linker (Gly4Ser)3相连.将该片段连接pGEX-4T-2,构建pGEX-4T-E1-2重组表达载体,转化BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳显示表达了约39 ku的融合蛋白.Westem blot分析表明该双表位重组蛋白可与T.sergenti阳性血清发生特异性反应,表明融合蛋白具有反应原性.     

BoLA-Ⅰ类基因在牛体细胞克隆胚早期发育中的表达

体外培养成熟的卵母细胞,通过核移植(Nuclear transfer,NT)技术,构建体细胞克隆(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)胚胎,以体外受精胚胎作为对照组。收集MⅡ期卵母细胞、2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚,采用实时荧光定量PCR的方法检测经典BoLA-I基因和非经典BoLA-I基因在MⅡ期卵母细胞及各期胚胎中的相对表达量。结果显示,BoLA-I类基因在在牛MⅡ期卵母细胞中的相对表达量显著高于其在其他各时期胚胎的相对表达量(P0.05);BoLA-I类基因在牛SCNT胚和IVF胚中相对表达量随胚胎发育的变化趋势类似,随着第1次及随后的卵裂,经典BoLA-I、NC1、NC2基因mRNA的表达下降到极微的水平;NC3、NC4在整个发育阶段均表达很低甚至难以检测到它们表达。结果表明,本试验通过在体外制备及培养SCNT胚胎,初步建立BoLA-I类基因在其的表达模式,为BoLA-I类基因参与母胎免疫机制的研究奠定基础,为进一步寻找评估胚胎质量的标志物提供依据。